Polinucleótidos
Extremo 5’ Enlace fosfodiéster Polinucleótido Extremo 3’
Formas de representación de polinucleótidos 5’- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3’ 5’-CATTGCGGAATGCC-3’ 3’-GTAACGCCTTACGG-5’
3’ 5’ Polinucleótido en doble hélice 5’ 3’
Propiedades de los polinucleótidos, 1 1. Absorción de luz UV a 260 nm Hipocromismo % A260, 120 En el DNA doble hélice se da el fenómeno de hipocromismo: el DNA desnaturalizado por el calor absorbe un 20-30 % más que el DNA nativo 110 100 T (ºC)
Propiedades de los polinucleótidos, 2 2. Reacción positiva de los polidesoxirribonucleótidos a la difenilamina y al reactivo de Schiff 3. Reacción positiva de los polirribonucleótidos al orcinol 4. Reacción con agentes intercalantes (acridinas) 5. Hidrólisis completa del RNA con álcali; el DNA es resistente a álcali.
Rotura química de polinucleótidos - Tratando un polinucleótido (DNA) con dimetil sulfato (DMS) tiene lugar la metilación de purinas; por calentamiento a pH neutro se rompe el enlace glicosídico y queda un sitio apurínico; el tra- tamiento ulterior con ácido diluído rompe la cadena por el sitio apurínico. - Tratando un polinucleótido (DNA) con hidrazina se rompe el enlace glicosídico de las pirimidinas, quedando un sitio apirimi- dínico; el tratamiento ulterior con piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidínico.
Calentamiento
Rotura enzimática de polinucleótidos Endonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados en el interior de una cadena polinucleotídica, y suelen ser específicas de cada ácido nucleico: - Ribonucleasas - Desoxirribonucleasas Exonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados en los extremos (3’ o 5’) de una cadena polinucleotídica, y suelen atacar indistintamente ambos tipos de ácidos nucleicos: - Exonucleasa de bazo (rotura tipo b) - Exonucleasa de veneno de serpiente (rotura tipo a)
Rotura tipo a: Da lugar a una mezcla de 5’-nucleótidos
Rotura tipo b: Da lugar a una mezcla de 3’-nucleótidos
Endonucleasas: DNAasa I: rotura completa, tipo a DNAasa II: rotura completa, tipo b RNAasa pancreática: rompe (b) enlaces Py-X RNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X Endonucleasas de restricción Exonucleasas: Exonucleasa de bazo: libera 3’-nucleótidos Exonucleasa de veneno de serpiente: libera 5’-nucleótidos
Endonucleasas de restricción, 1: 1. Reconocen secuencias específicas, por lo general palindrómicas: 5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’ 3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’ La secuencia reconocida en este caso es GAATTC
Endonucleasas de restricción, 2: 2. Suelen romper el polinucleótido dejando extremos cohesivos: 5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’ 3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’ AATTCCCAATAACCCTT -3’ GGGTTATTGGGAA -5’ 5’- ATCGTTGCCTACAATTG 3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAA Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la misma endonucleasa de restricción
Endonucleasas de restricción, 3: 3. Al reconocer secuencias relativamente largas, cortan el DNA por un número muy limitado de sitios, lo que facilita la manipula- ción experimental del mismo. Algunas endonucleasas de restricción: EcoRI GAATTC ClaI ATCGAT HaeIII GGCC RsrII CGGATCCG
Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa de restricción EcoRI, que es 5’-GAATTC-3’ En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y 20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar sería de 0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324 O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucleótidos
Separación electroforética de fragmentos de restricción del DNA. Una vez separados, se tratan con bromuro de etidio (un agen- te intercalante) y se observan bajo luz UV.
Método de Sanger para secuenciación de polinucleótidos
Síntesis en presencia de ddGTP
Síntesis en presencia de ddATP
Síntesis en presencia de ddCTP
Síntesis en presencia de ddTTP
A continuación, las cuatro mezclas se someten a electroforesis en poli- acrilamida-SDS. Este método sepa- ra polinucleótidos en función de su tamaño, de forma que los más cortos se desplazan más rápidamente. Como el cebador está marcado radioactiva- mente, revelamos la plancha de electroforesis por autorradiografía. Con esto leemos directamente la secuencia complementaria del poli- nucleótido inicial: 5’-AAGGCACATTCGATGCAAT- CGAATCGAACGTCCCAAAAG- GATTCCGGGAAAATG-3’