Tema 7.4 Presenta: Maritza Payan Parra 197446 CLONACION MOLECULAR Tema 7.4 Presenta: Maritza Payan Parra 197446

RESULTADOS DE APRENDIZAJE Comprende y explica los elementos y fundamentos de la clonación molecular. Explica los procedimientos básicos para la clonación molecular. Conocer y discutir aplicaciones de la clonación molecular en diferentes campos y actividades humanas.

ERRORES FRECUENTES Confundir la acción de las enzimas que participan en la clonación. No comprender el procedimiento de la clonación molecular.

CLONACION DEL DNA Comporta la separación de un gen especifico o de un fragmento de DNA de un cromosoma mucho mayor y su unión a una pequeña molécula de DNA portador, para después replicar este DNA modificado miles o millones de veces, mediante el aumento del numero de células y la creación de múltiples copias del DNA clonado en cada célula.

ELEMENTOS Segmento de DNA Vector Plasmido Porción del genoma de un virus bacteriano (l) Célula Enzimas

ENZIMAS UTILIZADAS EN LA TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE FUNCION Endonucleasas de restricción tipo II Cortan el DNA en secuencias especificas DNA ligasa Une dos moléculas o fragmentos de DNA DNA polimerasa I (E. coli) Rellena los huecos en el DNA duplex por adición secuencial de nucleótidos en los extremos 3` Transcriptasa inversa Hace una copia del DNA a partir de una molécula de RNA Polinucleotido quinasa Añade un grupo fosfato al grupo OH del extremo 5`de un polinucleótido para marcarlo o para permitir su ligación Transferasa terminal Añade colas homopolimericas al grupo OH del extremo 3`de un duplex lineal Exonucleasa III Elimina nucleótidos de los extremos 5`de una hebra de DNA Exonucleasa del bacteriófago l Elimina nucleótidos de los extremos 5`de un duplex para exponer los extremos 3`monohebra Fosfatasa alcalina Elimina fosfatos terminales tanto del extremo 5`como del 3`(o de ambos)

TIPOS DE ENDONUCLEASAS Las del tipo I cortan el DNA al azar.* Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de la secuencia de reconocimiento.* Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el DNA en la misma secuencia de reconocimiento. * Se mueven a lo largo del DNA mediante un mecanismo que requiere ATP

ESQUEMA BASICO Vector + Fragmento de DNA DNA Recombinante Replicación del DNA recombinante dentro de las células huésped Aislamiento, secuenciación y manipulación del fragmento de DNA purificado

CLONACION EN E. coli E. coli fue el primer organismo utilizado y todavía es la célula huésped mas común. Tiene muchas ventajas: Se conoce bien el metabolismo de su DNA. Muchos vectores de clonación que se encuentran asociados de manera natural, están bien caracterizados Se dispone de técnicas efectivas para la transferencia de DNA de una bacteria a otra.

INTERACCION DE LA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION EcoRV CON SU SECUENCIA DIANA Se muestra la enzima unida a los productos de corte de DNA en la secuencia reconocida por la endonucleasa. La proteína se ha eliminado y el DNA se ha rotado 180. La enzima crea extremos romos. Átomos de Mg en naranja.

Cortar el DNA en lugares determinados Cortar el DNA en lugares determinados. Las endonucleasas especificas de secuencia (endonucleasas de restricción) hacen las veces de tijeras moleculares. Selección de una pequeña molécula de DNA capaz de autoreplicarse. Vectores de clonación (plásmidos o DNA vírico). Unión covalente de dos fragmentos de DNA: La ligasa une el vector de clonación y el DNA que se desea clonar. Traslado del DNA del tubo de ensayo a una célula huésped que proporcionara la maquinaria enzimática necesaria para la replicación. Selección o identificación de las células huésped que contienen DNA recombinante.

Los fragmentos pueden ligarse a un plasmido CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION. Los fragmentos pueden ligarse a un plasmido

CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Un fragmento sintético de DNA que contenga las secuencias de reconocimiento de varias endonucleasas de restricción se puede insertar en un plásmido tratado previamente con una endonucleasa de restricción

DISEÑO DEL PLASMIDO pBR322 Posee un origen de replicación, en el cual las enzimas celulares inician la replicación (10-20 copias por célula) Contiene dos genes que confieren resistencia a antibióticos. Varias secuencias únicas de reconocimiento para diferentes endonucleasas suministran los sitios donde cortar para insertar las secuencias de DNA foráneo. Su pequeño tamaño facilita su entrada en la célula y la manipulación bioquímica del DNA.

CLONACION E IDENTIFICACION DE DNA FORANEO EN E. coli pBR322 se corta en el elemento de resistencia a ampicilina. El DNA foráneo se liga al pBR322 cortado. Si tiene éxito, el elemento de resistencia a la penicilina es inactivado. Se transforman las células de E. coli. Después se cultivan en placas de agar que contienen tetraciclina para seleccionar aquellas que han incorporado el plásmido. Las colonias individuales se transfieren a posiciones equivalentes de placas adicionales. Una placa contiene tetraciclina y la otra ampicilina.

Los plasmidos recombinantes se agregan a un cultivo bacteriano que se trato antes con iones de calcio. Se someten a un breve golpe de calor y las bacterias se estimulan para que capten el DNA del medio. El plasmido se replica en forma autónoma en la célula receptora y se pasa a la progenie durante la división celular.

CLONACION DE DNA EUCARIOTA EN GENOMAS DE FAGOS El DNA digerido se fracciona por electroforesis en gel o centrifugación con gradiente de densidad y los fragmentos de 20 kb de largo (aprox) se incorporan

EL FRAGMENTO LAMBDA El DNA se empaca bien en una forma que es facil de almacenar y extraer. Todo paquete que contenga un DNA recombinante es capaz de infectar una celula bacteriana. Una caja Petri puede contener mas de 100,000 placas diferentes.

EL CROMOSOMA ARTIFICIAL BACTERIANO Puede aceptar grandes fragmentos de DNA (hasta 500 kb) Son plasmidos bacterianos especializados

EL CROMOSOMA ARTIFICIAL DE LEVADURA Puede aceptar segmentos de DNA de hasta 1000 kb Son versiones artificiales de un cromosoma artificial de levadura

APLICACIONES El 24 de febrero de 1997 el Instituto Roslin, de Escocia, se anuncia la reproducción con éxito de la oveja "Dolly". En julio de 1997 los mismos científicos que habían clonado a "Dolly" produjeron el cordero "Polly" que porta genes humanos. En noviembre de 2001 la empresa Advanced Cell Technology (ACT) consiguió clonar el primer embrión humano de la historia, aunque su desarrollo se detuvo de forma natural cuando sólo contaba con seis células, mucho antes de alcanzar la fase de blastocito, necesaria para obtener las llamadas células madre. El objetivo era el de obtener células madre para la investigación de terapias génicas. En enero 2002, la empresa escocesa PPL Therapeutics anuncia el nacimiento de unos cerditos, a los que se les pudo eliminar el gen que causa que el sistema inmunológico del ser humano rechace transplantes de los órganos del cerdo.

En enero de 2002, los creadores de la oveja Dolly, anuncian que el animal sufre artritis, por el envejecimiento prematuro que padece, a sus cinco años de edad. En febrero de 2002 un equipo investigador que había clonado una docena de ratones informó de que ninguno de ellos logró sobrevivir. Además un equipo investigador japonés llamó la atención sobre la mayor frecuencia de abortos, deformidades, sobrepeso y muertes prematuras entre otros animales que habían sido clonados. También en febrero de 2002, la Universidad A&M de Texas presentó el primer gato clonado del mundo, un cachorro de dos meses de edad al que llamaron "CC", siglas de "copia al carbón". Según los científicos "los gatos tienen una forma felina del síndrome de inmunodeficiencia humana que es un buen modelo para el estudio del sida humano". En noviembre de 2002 el experto italiano en fertilidad Severino Antinori dice que espera que una paciente dé a luz un bebé clonado en enero de 2003.

RATONES TRANSGENICOS Se muestra un par de hermanos de la misma camada de 10 semanas de edad. El mas grande se desarrollo con un huevo inyectado con DNA + GH. El mas grande pesa 44 gr, y el pequeño 29 gr. El gen GH se transmitió a los descendientes.

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