Militza Díaz Myriam Cintrón Nemesis Nieves Separación e Identificación de una Proteína en la Leche Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias y Matemáticas

I NTRODUCCIÓN  La leche es considerada el alimento perfecto dada su aportación de vitaminas, minerales, proteínas, carbohidratos y grasa.  De las proteínas incluidas, es la caseína la más abundante, conformando aproximadamente un 80% de la proteína total en su contenido.  La caseína posee todos los aminoácidos esenciales necesarios para el crecimiento y está presente en la leche como caseinato de calcio, una sal de calcio soluble en agua.

Caseína Caseinato Punto Isoeléctrico Micela T EORÍA Y T ÉRMINOS C LAVES

C ASEÍNA Las caseínas son fosfoproteínas, es decir, grupos fosfatos que están unidos a algunos amino ácidos de las cadenas laterales. Se reconoce como una mezcla de al menos tres proteínas similares, α, β y κ, diferenciadas por su peso molecular y la cantidad de fósforo que contienen.

M ICELA Se describe como una formación geométrica de moléculas, que poseen una "cabeza" polar y una "cola" de naturaleza no polar, adheridas a un partícula o glóbulo de una sustancia que se encuentra en un medio en el cual no es soluble.

C ASEINATO DE C ALCIO  En la leche, la caseína está presente como una sal cálcica que tiene una estructura compleja y conformada por las caseínas α, β y κ, formando una micela o unidad de solubilización.  Aunque la forma α y β no son solubles en la leche, al agregar la caseína κ a alguna de ellas o sus combinaciones, se obtiene una caseína compleja que es soluble debido a la formación de esta micela.

P UNTO I SOELÉCTRICO  El pH de la leche está alrededor de 6.6, manteniendo a caseína con una carga negativa neta y presentándola como sal en solución.  De acuerdo a la insolubilidad de caseinato cálcico en medios con pH menor a 4.6 (PI del mismo), es que se dice que caseína no se desnaturaliza, pero puede precipitarse en medio ácido.  Es así, que si se acidifica la leche, la carga eléctrica negativa del exterior de la micela se neutraliza ante los iones H + del ácido y la proteína neutra precipita o coagula. Ca 2+ Caseinato + 2HCl > Caseína + CaCl 2

O BJETIVOS  Mediante este protocolo se espera evaluar la presencia de caseína en una muestra dada de leche en polvo comercial.  Experimentalmente se espera determinar el porciento de la misma en aproximadamente gramos de leche en polvo.

E QUIPO ReactivosMateriales  Aprox 10 gramos de leche en polvo  Ácido acético 10%  Éter etílico  Termómetros (~ 40 – 50°C)  Papel de filtro para Buchner  Envase para desperdicios de éter  Papel toalla  Embudos Buchner y matraz de filtración al vacio  2 vasos de precipitado de 150 mL o cerca por mesa  Agua purificada  Vaso de precipitado adicional de 50 mL o cerca

P ROCEDIMIENTO  Se pesó g de leche en polvo sin grasa y se disolvieron en 40 mL de agua tibia en un vaso de 150 mL. Se utilizó un termómetro para mantener la temperatura entre 40-50ºC.  Se añadió gota a gota una solución de ácido acético 10% agitando la solución.

P ROCEDIMIENTO  Se continuó añadiendo el ácido hasta que el líquido cambió de su color de leche original a una solución clara, indicativo de que la caseína está mayormente separada (este paso tomó aproximadamente la adición de 80 a 90 gotas del mismo).  Se agitó la solución hasta que se obtuvo una masa amorfa, acto seguido se removió la masa con un agitador y se pasó a un vaso de precipitado limpio.

P ROCEDIMIENTO  Se decantó la solución con el contenido de caseína para remover la mayor cantidad de líquido posible.  Se colocó la caseína en un vaso de precipitado pequeño y añadió 10 mL de éter etílico agitando la caseína en el éter durante un par de minutos.  Se decantó el éter y se repitió el proceso con una porción adicional del mismo, este paso favoreció el remover pequeñas cantidades de grasa que puedan precipitar con la caseína.  Se colocó la caseína obtenida en un cristal de reloj y se favoreció el secado hasta el próximo periodo.

R ESULTADOS Peso del cristal de reloj vacío 45.50g Peso del recuperado y el cristal de reloj 50.27g Peso del recuperado 50.27g g = 4.77g Tabla A : Datos de pesada antes, durante y después del proceso de separación de caseína en una muestra de leche comercial

C ÁLCULOS  Porciento de rendimiento Peso seco de la caseína (g) (100) 4.77g (100) = 47.23% Cantidad de leche utilizada (g) g

D ISCUSIÓN  Durante la realización de este experimento, se presentaron problemas de funcionamiento con el uso del embudo Buchner y el matraz de filtración al vacío por lo que se optó por sustituir este sistema por la técnica manual de decantación.  Aunque se recuperan 4.77g totales de proteína, teóricamente se dice que de las proteínas aisladas de la leche, solamente 79-82% corresponde a caseína.  A manera de contrastar los gramos reales de caseína en la leche comercial, se presentan diferentes datos de peso y composición de la leche en polvo, leche de cabra y oveja.

D ISCUSIÓN Tabla B: Contenido de caseína en leches de consumo ( g de leche en polvo contienen 23.0 g de proteína -3.20g de proteína total en muestra de 10.10g -2.56g de caseína por muestra en uso

Tabla C: Componentes principales de la leche de vaca y sus funciones (

C ONCLUSIONES  Habiendo llevado a cabo esta práctica se observar la coagulación enzimática de la caseína por efecto del punto isoeléctrico; razón por la cual luego de adicionar el ácido, la leche se precipita casi totalmente, perdiendo su solubilidad y adquiriendo por ende el aspecto de un gel granulado con color amarillo pálido.  El punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, porque los grupos ácidos se protonan dejando de repelerse las micelas debido a la reducción de repulsiones intermoleculares por lo que se precipita al añadir el ácido.

GRACIAS!! PREGUNTAS?

R EFERENCIAS  Eaton, D.C. (1989). Laboratory Investigations in Organic Chemistry. New York.: McGraw Hill.  Ramírez, J. R., Vivoni, A. (2016). Bioquímica: Separación e Identificación de una Proteína en la Leche. Universidad Interamericana de Puerto Rico: Recinto de Bayamón.  Sovoronos, P., Sarlo, F. & Kulawiec, R. (1996). Organic Chemistry Laboratory Manual. Second Edition. Dubuque. IA.: Wm C. Brown Publishers.  oquimica/aislamiento-de-caseina-reaccion-de- bial-punto-isoelectrico oquimica/aislamiento-de-caseina-reaccion-de- bial-punto-isoelectrico  /grasayproteina_1796.pdf /grasayproteina_1796.pdf  o=y&id=430&boletin=100 o=y&id=430&boletin=100  uimica/bioquimica-i/obtencion-de-caseina- reaccion-de-biuret-y-punto-isoelectrico uimica/bioquimica-i/obtencion-de-caseina- reaccion-de-biuret-y-punto-isoelectrico  ml ml   /protenas_leche_y_casena.pdf /protenas_leche_y_casena.pdf  suero-leche/ suero-leche/  om/2013_06_01_archive.html om/2013_06_01_archive.html