Búsqueda de productos naturales con actividad anti-Trypanosoma cruzi: Nuestra experiencia Dr. Mauricio Cabrera Primer Congreso Nacional de Prevención y Control de la Enfermedad de Chagas: “Dr. Rafael A. Cedillos”. El Salvador | Julio de 2013 Lab. Química Orgánica | Facultad de Química-Facultad de Ciencias | UdelaR | Montevideo | Uruguay

T. cruzi: ciclo de vida

Una breve introducción de la relevancia de los productos naturales como agentes farmacológicos y en particular como agente anti-T. cruzi. Puse unas imágenes de algo que encontré por ahí

MATICO Reino: Plantae División: Magnoliopsida Especie: Aristeguietia glutinosa Lam. o Eupatorium glutinosum Lam. Nombre común: Matico, Yerba del soldado, Chuzalongo, Matigo, Migla Arbustos perennes que alcanzan una altura de 1 a 3 m. Presentan ramas grises, hojas aromáticas, opuestas de color verde brillante, de 7 a 10 cm de largo por 2.5 a 3.5 cm de ancho, de base cordada, ápice agudo, margen dentado, haz verrucosa brillante, y envés tomentoso albescente. Panículas de 10 – 15 cm de longitud por 12 cm de ancho, laxas. Brácteas café oscuras. Las flores son tubulares, en espigas solitarias, de tonalidad fucsia. El fruto es de color negro y contiene una semilla pequeña oscura en su interior. Cipsela de 2.5 mm de longitud por 1 mm de ancho, glabro de color crema. Planta nativa de la Sierra del Ecuador que crece al borde de caminos, entre los matorrales cordilleranos y plantaciones en la región interandina del Ecuador, entre 3000 a 3700 m sobre el nivel del mar, así como también a la vera de los caminos, como matorrales. Nuestro interés comienza con la planta Matico, de origen ecuatoriano, la cual según el grupo de la Dra. Ximena Chiriboga de la Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Central del Ecuador. Dra. X. Chiriboga (Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Central del Ecuador)

La medicina tradicional le atribuye a las hojas en decocción propiedades como cicatrizante, en lavados antisépticos sobre heridas y en infusión para evacuar cálculos biliares, para aliviar o curar enfermedades del tracto respiratorio (antiinflamatorio, expectorante y antitusígeno). Estudios previos han descrito el aislamiento de ciertos componentes del extracto metanólico de Matico con actividad antibacteriana (A-G). Chiriboga et al. describe que el extracto etanólico, de las partes aéreas, del Matico Ecuatoriano posee actividad antibacteriana y antifúngica. Dado que Chiriboga describe que su extracto hidro-etanólico (de las partes aéreas) posee actividad antifúngica y dado que Urbina en Venezuela describe que ciertos fármacos antifúngicos son buenos antichagásicos, resolvimos realizar en Uruguay un estudio bioguiado.

MATICO: extracto hidro-etanólico La primera etapa consistió en evaluar el extracto hidro-etanólico, sin ningún tipo de aislamiento, sobre la forma epimastigote de T. cruzi. Observando una muy buena actividad, una IC50 de 19.6 migrogramo por mL Esto nos llevó a intentar aislar el o los metabolitos secundarios activos, a través de un procedimiento de aislamiento bio-guiado

Estudio bioguiado: Un aislamiento bioguiado consiste en realizar un aislamiento con la concomitante evaluación biológica, en nuestro caso sobre T. cruzi y sobre macrófagos para estudiar la selectividad

Entonces el procedimiento consistió, a partir del extracto hidro-etanólico seco, realizar un fraccionamiento por polaridades. Así se separa los componente orgánicos (solubles en diclorometano) y los inorgánicos u orgánicos polares (solubles en agua). Al evaluar biológicamente sobre T. cruzi se identifica actividad en la capa orgánica y ausencia absoluta de actividad en la capa acuosa. Cada capa es evaporado su disolvente, a vacío en el caso del diclorometano y por liofilización en el caso del agua.

Luego la capa de diclorometano, se vuelve a fraccionar en una fase apolar (hexano) y una fase polar (metanol:agua). Encontrando actividad leve en la capa hexánica y mantenimiento de la BUENA actividad en la capa metanólica por ello se sigue con esta capa

Sobre la fase metanólica se fracciona por columna de cromatografía con polaridad creciente (desde EP hasta metanol), aislando en forma definida el compuesto 1, 2, una fracción compuesta por más de un compuesto y la fracción que queda en el origen (sacada con MeOH), los resultados biológicos de todos es

Aquí se resumen todos los datos, en las curvas se muestran las curvas dosis-respuestas para los dos compuestos más relevantes. Y en la tabla de todas las fracciones aisladas, hacer hincapié como se pierde la actividad desde el extracto hidroalcohólico a la capa acuosa, y se mantiene en el diclorometano, y luego como el metanol es más activo que el EP y finalmente como los compuestos son más activos. Y que las fracciones más polares, F3 y PM, no son activos. Las IC50 de 1 y 2 se ponen en micromolar porque después elucidamos las estructuras y tenemos los PM. El compuesto 1 es el más activo.

Concomitantemente se evalúa la toxicidad, por hemolisis de glóbulos rojos (porque algunos labdenos, ya que son de estas estructuras los compuestos 1 y 2, han mostrado previamente actividad hemolítica), por toxicidad sobre macrófagos murinos y por mutagenicidad. El compuesto 1 mostró tener un buen índice de selectividad (en cuanto a hemolisis), baja toxicidad sobre macrófagos y especialmente ausencia de mutagenicidad.

La otra etapa química, fue la elucidación estructural de 1 y 2 La otra etapa química, fue la elucidación estructural de 1 y 2. La misma se hizo por técnicas espectroscópicas, RMN, MS, IR, UV El producto 1 (fracción 2), el más activo, resultó ser un aldehído derivado de labdeno. Su estereoquímica se determinó por estudios NOESY. El poder rotatorio específico indica que se trata de la forma dextrógira del diasterómero indicado. Los experimentos no permitieron determinar la posición espacial del metilo de la cadena lateral.

El compuesto 2, fracción 1, resultó ser la lactona que se muestra El compuesto 2, fracción 1, resultó ser la lactona que se muestra. Esta lactona, en su forma levógira, había sido descrita previamente en otro tipo de planta.

lovastatina Matico 1 2 Tbf C La Co Er Es Antes los resultados tan promisorios, se decide: Realizar estudios de mecanismo de acción: esteroles, RMN Estudios in vivo de actividad anti-T. cruzi En cuanto al estudio de la modificación de esteroles de membranas, éste es uno de los mecanismos que propone Urbina en Venezuela para los agentes antifúngicos en Chagas, pero por otro lado nuestros compuestos tienen similitud estructural con lovastatina y otras estatinas inhibidoras de la biosíntesis de colesterol. Para estudiar este posible mecanismo de acción, se tratan epimastigotes de T. cruzi con los compuestos, luego se destruyen los parásitos y se estudia por cromatografía (en este caso capa fina) la acumulación de algunos de los intermedios en la biosíntesis de esteroles de membrana de T. cruzi, escualeno, lanosterol y ergosterol. Lo que pudimos observar es que ninguno de los compuestos estudiados, en las condiciones ensayadas, son capaces de acumular escualeno, lanosterol y ergosterol. Por lo que aparentemente no estarían actuando a este nivel. Matico 1 2 Tbf C La Co Er Es

Compounda/metabolite T. cruzi s/tratamiento T. Cruzi tratado con 2 El otro estudio, fue el realizar un estudio de metabolómica por RMN. Para ello estudiamos el cambio en el perfil de metabolitos excretados por T. cruzi, con y sin tratamiento de los compuestos. Este método, permite cuantificador AA como glicina y alanina y ácidos carboxílicos como lactato, acetato, piruvato y succinato. El procedimiento se hace, mínimo, por triplicado y se realiza el estudio estadístico. Aquí se muestra para un T. cruzi sin tratar y para otro tratado con 2. Se observa que clara y estadísticamente que Matico y el compuesto 2, depletan succinato, acetato y alanina, mientras que el compuesto 1 aumenta los niveles de acetato excretados al medio de cultivo. Compounda/metabolite Gly (3.552 a 3.442b) Succ (2.402 a 2.376) Pyr (2.367 a 2.317) Ace (1.928 a 1.882) Ala (1.488 a 1.436) Lac (1.338 a 1.296) Matico 2,96 ± 0,02 7,27 ± 0,09 22,04 ± 0,54 27,39 ± 0,67 24,78 ± 0,38 11,81 ± 0,01 2 2,71 ± 0,01 8,07 ± 0,37 21,31 ± 0,98 26,66 ± 1,06 23,04 ± 0,23 11,46 ± 0,07 1 3,07 ± 0,03 11,96 ± 0,52 23,87 ± 0,65 32,12 ± 0,83 27,13 ± 0,48 12,74 ± 0,19   Medioc 2,97 ± 0,01 11,96 ± 0,01 22,22 ± 0,02 29,67 ± 0,23 27,35 ± 0,17 11,78 ± 0,11

Compounda/metabolite Teniendo en cuenta el mapa metabólico de T. cruzi, los cambios en succinato, acetato y alanina están mostrando que la mitocondria no funciona como debería, específicamente el incremento de los dos primeros podrían mostrar que las deshidrogenasas mitocondriales no son operativas. Más experimentos deben ser realizados (y están en marcha). Compounda/metabolite Gly (3.552 a 3.442b) Succ (2.402 a 2.376) Pyr (2.367 a 2.317) Ace (1.928 a 1.882) Ala (1.488 a 1.436) Lac (1.338 a 1.296) Matico 2,96 ± 0,02 7,27 ± 0,09 22,04 ± 0,54 27,39 ± 0,67 24,78 ± 0,38 11,81 ± 0,01 2 2,71 ± 0,01 8,07 ± 0,37 21,31 ± 0,98 26,66 ± 1,06 23,04 ± 0,23 11,46 ± 0,07 1 3,07 ± 0,03 11,96 ± 0,52 23,87 ± 0,65 32,12 ± 0,83 27,13 ± 0,48 12,74 ± 0,19   Medioc 2,97 ± 0,01 11,96 ± 0,01 22,22 ± 0,02 29,67 ± 0,23 27,35 ± 0,17 11,78 ± 0,11

Se inyectan ratones entre 6 y 8 Blac ip con 5000 parasitos Brener, tripomastigota. Dias post infección, el tratamiento comienza cuando el 80 % de los ratones son positivos. Tratamiento 15 dias via oral consecutivos. A los 30 dias se produce IgG, desaparece la forma sanguinea (tripo), el parasito se aloja en los tejidos amastigota (forma intracelular replicativa). Para los estudios in vivo, se eligió el compuesto más promisorio, 1, y el extracto hidroetanólico entero. Para el compuesto 1, se utilizaron dos dosis diferentes, ambas por debajo de la dosis del extracto hidroetanólico de matico. Se administró durante 14 días por vía oral y se siguió la parasitemia semanalmente, utilizando benznidazol (agente antichagásico mutagénico) como control positivo del ensayo. Los resultados fueron altamente promisorios ya que en todos los casos la parasitemia estuvo por debajo del control sin tratamiento.

Primeras conclusiones Se identificó actividad anti-T. cruzi en una planta sudamericana Se aislaron dos principios activos que han superado las etapas de prototipos. Se estudiaron mecanismos de acción, aproximándonos a los mismos Se ha realizado prueba de concepto, con estudios in vivo que ubican a uno de los prototipos a situación de líder Es posible usar extracto de Matico directamente, lo cual aumenta el valor agregado de un producto vernáculo con potencial uso en el tratamiento de afecciones propias de nuestro continente

Ante el éxito con este estudio, decidimos, hace dos años iniciar un trabajo de búsqueda de principios anti-T. cruzi en plantas uruguayas. Para seleccionar las mismas usamos el siguiente criterio: Distribución preferencial, no exclusiva, en Uruguay Descripción previa de cierta actividad antibacteriana o antifúngica Descripción farmacognósica de algún tipo de compuesto similar a los presentes en Matico (labdenos) Fácil recolección y abundante producción Diversidad de distribución en nuestro territorio

Hydrocotyle bonariensis Achyrocline satureioides Taraxacum officinale Las plantas elegidas fueron: Hydrocotyle bonariensis Baccharis trimera Baccharis articulata Baccharis crispa Achyrocline satureioides Taraxacum officinale Plantago major Plantago major Baccharis trimera Baccharis crispa Baccharis articulata

- Parte botánica: rizoma, tallo, hoja y flor Hydrocotyle bonariensis Achyrocline satureioides Taraxacum officinale - Época de recolección - Parte botánica: rizoma, tallo, hoja y flor Terreno de recolección: arena, piedra y tierra Para cada una de estas especies se estudió (en esta primera etapa se han hecho todos extractos HIDROETANÓLICOS): Diferentes épocas del año (ya que en Uruguay existen claramente las cuatro estaciones) Diferentes partes botánicas: raices, rizomas, tallos, hojas y flores Diferente distribución geográfica: terrenos arenosos, pedregosos y tierra normal Además, de considerar un estudio bio-guiado, o sea trabajar con extractos de diferentes polaridades y evaluar su actividad frente al parásito y frente a macrófagos murinos (para saber selectividad). Plantago major Baccharis trimera Baccharis crispa Baccharis articulata

Localización geográfica Hydrocotyle bonariensis Planta Época y terreno Localización geográfica Parte vegetal Rendimiento Act. anti-T.cruzi H. Bonariensis Feb 2012, arenoso Santa Teresa Hojas 8.6% 23,3 ± 0,4 µg/mL Tallos y raíces 1.6% 7,6 ± 0,9 µg/mL Flores 3.8% 5,2 ± 1,6 µg/mL Jun 2012, sierras/arena Cuchilla Alta 8.50% 46,5 ± 5,0 µg/mL H. bonariensis 5.50% < 25 µg/mL Algunos datos relevantes los hemos observado con Hydrocotyle bonariensis, "redondita de agua“, donde hay diferencias en la actividad biológica según la parte de la planta, siendo el extracto de flores y el tallos-rizomas los más activo. Estos dos extractos fueron más activo que matico. La misma distribución de actividad según la parte botánica fue observada en las muestras de junio y terreno de piedra-arena, donde tallos-rizomas fueron más activos. En esta época no hay fores.

Localización geográfica Planta Época y terreno Localización geográfica Parte vegetal Rendimiento Act. anti- T.cruzi B. trimera Feb 2012, sierras Villa Serrana Hojas y flores 15.10% 51,5 ± 7,6 µg/mL Feb 2012, arenoso Jaureguiberry 18.70% > 100 Punta del Este 9.30% 97,5 ± 3,5 Santa Teresa 68,9 ± 11,7 También con Baccharis trimera "carqueja“ (colecta febrero 2012) que presentan actividad variada según su origen geográfico siendo las de sierras (Villa serrana) las más activas. Las de origen arenoso y cercanas al mar (Jaureguiberry, Punta del Este, Santa Teresa), de igual origen botánico y misma época de recolección, presentan menor actividad. De todas formas los resultados obtenidos hasta el momento aún no alcanza la actividad de Matico. Aunque esto no quiere decir nada, porque dependerá de la selectividad. Baccharis trimera

Localización geográfica Planta Época y terreno Localización geográfica Parte vegetal Rendimiento Act. anti- T.cruzi B. trimera Feb 2012, sierras Villa Serrana Hojas y flores 15.10% 51,5 ± 7,6 µg/mL Feb 2012, arenoso Jaureguiberry 18.70% > 100 Punta del Este 9.30% 97,5 ± 3,5 Santa Teresa 68,9 ± 11,7 B. articulata Hojas 18.80% 23,0 ± 3,0 µg/mL B. Articulata 19.90% 22,5 ± 4,0 µg/mL Un último ejemplo interesante es Baccharis articulata "carquejilla“, que comparándola con la otra Baccharis, para la misma época del año y los mismos lugares de recolección, presenta: el mismo valor de actividad biológica en muestras de sierras y arena, resultado que difiere con B. trimera,  presenta mayor actividad que B. trimera se aproxima un poco más a Matico Baccharis trimera Baccharis articulata

Paralelamente al estudio bio-guiado se está realizando un estudio: Cromatográfico, para conocer las similitudes en composición entre las distintas partes botánicas, épocas del año y zonas de recolección para cada planta Espectroscópico (RMN), para conocer las similitudes en composición entre las distintas partes botánicas, épocas del año y zonas de recolección para cada planta

Segundas conclusiones: Se identificó actividad anti-T. cruzi en ciertas plantas uruguaya. Es posible usar los extractos de algunas de estas plantas en el tratamiento de afecciones propias de nuestro continente.

Integrantes del trabajo: Agradecimientos Javier Varela Estefanía Birriel Hugo Cerecetto Mercedes González Martín Gabay Ma Laura Lavaggi Eduardo Alonso (Botánico, Uruguayo) Ximena Chiriboga (Ecuador) Patricio Miño (Ecuador) Ninfa Vera de Bilbao (Paraguay) Agradecimientos RIDIMEDCHAG-CYTED ANII PEDECIBA CSIC-UDELAR