Gene editing Sistema CRISPR – Cas9 Ariel Waisman 2015

CRISPR – Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Sistema de defensa de procariotas contra el ataque de virus Función: destruir el genoma - ADN / ARN - viral Existen 11 sistemas distintos De qué organismo provienen Tipo de proteína Cas Target: RNA o DNA

CRISPR – Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Regiones Spacer repetitivas Regiones protospacer de origen viral Protospacers guideRNAs

CRISPR – Cas9 Destrucción del genoma viral Double Strand Break!!

CRISPR – Cas9 2012 NUCLEASA (Cas) RNA GUÍA

¿Puedo “targetear” cualquier secuencia de un genoma? Compuesto por… La endonucleasa Cas9 5′-NGG sgRNA Secuencia guia Secuencia “Scaffold” ¿Puedo “targetear” cualquier secuencia de un genoma? Requerimiento: la secuencia target tiene que estar seguida inmediatamente río abajo por una secuencia PAM: 5′-NGG

CRISPR – Cas9

¿Cómo nos podría servir esto para hacer Gene editing? Capacidad de eliminar, reemplazar, modificar secuencias de un genoma en forma altamente específica No al azar! Aprovechando los mecanismos de reparación del ADN en las células Sistema que genera DSB en una secuencia determinada por el sgRNA Para trasladar CRISPR a eucariotas… Cas9 + sgRNA

Una vez generado el DSB en el genoma… Dos formas de repararlo: Genera INDEL mutations Cambio marco de lectura O aparición de STOP prematuro Non homologous end joining (NHEJ) Se knockea el alelo Homology-directed repair (HDR) Si además agregamos un vector “de reparación” con secuencias homólogas flanqueando la modificación que se quiere hacer… Knock in del alelo

+ Homology-directed repair (HDR) Si además agregamos un vector “de reparación” con secuencias homólogas flanqueando la modificación que se quiere hacer… +

¿Cómo hacemos que se exprese la Cas9 y el sgRNA? Vector básico: O variantes…

Pero… Off-targets! …todo es color de rosas? ¿Algo puede malir sal? ¿Cuán específico es? Cuidado con los Off-targets! Lo bueno: Software permite predecirlos en base a su secuencia y verificarlos

Entonces… Queremos generar una línea celular con un alelo de un gen “A” knockeado… Diseñar secuencia guía teniendo en cuenta PAM (5’ – NGG) Se hace con la ayuda de un software Clonar secuencia guía en el vector sgRNA/Cas9 Transfectar células con el vector En células transfectadas (no todas) se expresa Cas9 y sgRNA. En algunas, ocurre el DSB en algún alelo (o en ambos) IF knock-in, tmb vector de reparación Seleccionar células transfectadas (Puromicina, si usamos pspCas9) Seleccionar clones recombinados (Ejemplo, expresión de GFP de HDR) (o el knock-in lleva tmb gen de resistencia a otro ATB, ej, neomicina) Validarlos (PCR genómica y secuenciación, etc) Validar no haber generado OFF-targets (PCR genómica y secuenciación, etc)

¿Sirve para hacer transgénicos? Puff, y cómo! Por ejemplo, en ratones: Una forma Modificar células madre embrionarias Inyectarlas en blastocistos (embriones tempranos) Obtener animales quimera Otra forma Directamente inyectan zigotos con RNA de Cas9 y sgRNA!! Modifican 5 genes distintos en un solo paso!!!

¿Y terapia génica…? Ratones con una mutación puntual en el gen Fah Mueren por daño hepático Les inyectan sgRNA + Cas9 + secuencia de reparación por HDR ssDNA de 180 b!! Bracitos de homología + reparación de la mutación

Ventajas del sistema CRISPR Sólo hay que diseñar un sgRNA y no una proteína! Es mucho más barato, más rápido y más fácil Más eficiente que Zinc finger nucleases y que TALEN Se pueden hacer múltiples modificaciones en el genoma al mismo tiempo. Ratones con muchos genes mutados al mismo tiempo Grandes deleciones usando 2 target sites

Ademas… Se diseñaron variantes la proteína Cas9 nCas9: Proteína “nickasa”. En vez de generar DSBs, genera nicks en una cadena. Reduce la frecuencia de NHEJ y favorece HDR Cas9 sin actividad endonucleasa: se dirige al sitio, pero no lo corta: Se la puede fusionar a GFP y mostrar la ubicación de un locus en células vivas. Se la puede fusionar a un activador / represor de la transcripción y modificar la actividad de un gen endógeno

Desventajas y peligros Su rápida evolución deja poco tiempo al análisis ético y de bioseguridad Organismos editados por CRISPR podrían perturbar ecosistemas Se han modificado embriones humanos con CRISPR en el laboratorio. Creación de virus que distribuyen CRISPR para generar modelos de cáncer de pulmón El peligro de los Off-target en el uso biomédico Conclusión… CRISPR-Cas9 arrancó con todo! Se pudo editar el genoma de líneas celulares humanas, ratones, zebra fish, plantas, drosophila, C. elegans, levaduras y bacterias. Y recién empieza!

Gracias!