BOLILLA 1 ENZIMAS: Naturaleza Química- Propiedades Generales- Nomenclatura y Clasificacion- Coenzimas y Grupos Prostéticos. Actividad Enzimática: Unidad de enzima- Actividad específica- Actividad molecular. Complejo ES- Ecuación de Michaelis Menten y Ecuación de Lineweaver Burk- Significado e importancia de Km y Kcatalítica- Inhibición competitiva y no Competitiva. Factores que afectan la actividad enzimatica: [Enzima]- pH – T- [S] Regulación Enzimática: Enzimas alostéricas (propiedades y cinética)- Zimógenos- Modulación Covalente Isoenzimas: Propiedades e importancia.

ENZIMAS Transformación de nutrientes simples en moléculas complejas y viceversa Extracción de energía desde combustibles por oxidación Polimerización de subunidades para formar macromoléculas, etc

CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS PROTEINAS y RNA (Ribozimas): Estructura terciaria y cuaternaria SITIO DE UNION AL SUSTRATO: Uniones no Covalentes (puente de hidrógeno, hidrofóbicas, electrostáticas NECESITAN DE FACTORES ENZIMATICOS: Inorgánicos (metales) y orgánicos (Coenzimas) ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO: Estereoespecificidad y especificidad geométrica SON REGULABLES: La síntesis de la proteína, su actividad y degradación.

DISTRIBUCION DE LAS ENZIMAS COMPARTIMENTALIZACION: Diferentes localización dentro de la célula. SISTEMAS MULTIENZIMATICOS: Enzimas relacionadas agrupadas formando verdaderos complejos ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: Una enzima que presenta distintos sitios catalíticos

USOS DE ENZIMAS EN BIOTECNOLOGIA Mutagénesis Dirigida: - Estudiar mecanismos enzimáticos - Cambiar especificidades enzimáticas - Aumento de tolerancia a condiciones extremas. Enzimas híbridas. Proteinas de fusión Ej. Activ.de glucanasas y celulasas microbiana, Activ.Nucleasa estafilococica

Tipos de reacciones catalizadas por enzimas Oxido-reducción Rotura y formación de enlaces C-C Reorganizaciones internas Transferencia de grupos Reacciones de condensación

Cómo se clasifican las enzimas??? Clase - subclase - subsubclase - nº de orden Lactato 1 1 1 27 deshidrogenasa 1-OXIDORREDUCTASAS Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) 2. TRANSFERASAS Hexoquinasa (EC 2.7.1.2)

3. HIDROLASAS 4. LIASAS 5. ISOMERASAS 6. LIGASAS Carboxipeptidasa A (EC 3.4.17.1) 4. LIASAS Piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1) 5. ISOMERASAS Fumarasa ó malato isomerasa (EC 5.2.1.1) 6. LIGASAS Piruvato carboxilasa (EC 6.4.1.1)

VITAMINAS-COENZIMAS Niacina NAD, NADP Ion Hidruro (:H -) PDH GAD Riboflavina (Vit.B2) FAD, FMN Electrones SDH Tiamina (Vit. B1) PP-tiamina Aldehídos PDH, TC Acido pantoténico Coenzima A Grupos acilo Tiolasa Acido fólico TH4 Grupos monocarbonados Ser-Treon. Deshidrat. Piridoxina (B6) P-piridoxal Transferencia grupos aminos GPT AAC-DESC Acido lipoico Lipoamida Electrones y grupos acilos. PDH

Ejemplos de Enzimas que requieren iones metálicos como cofactores Fe++ ó Fe+++ Citocromo oxidasa Catalasa Peroxidasa Zn++ Anhidrasa carbónica Hexoquinasa Glucosa-6-fosfatasa Piruvato quinasa Mg++ K+ Piruvato quinasa

mmol de S transformados mmol de S transformados/min ACTIVIDAD ENZIMATICA Unidades Internacionales Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 umol de S por minuto Actividad Específica Actividad enzimática por cada miligramo de proteína presente en la muestra Actividad Molecular ó Numero de Recambio Moléculas de S convertibles en P por unidad de tiempo y por molécula de enzima U.I.E. = mmol de S transformados min 1 katal = 6 x 107 U.I.E. Actividad específica = U.I.E. mgr de proteína Actividad molecular = Mol de enzima mmol de S transformados/min

ACTIVIDAD ESPECIFICA A B + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ D específica U.I.E. mgr de proteína = Activ. Enzimática Prot. totales Prot.Tot: ∑

Como funcionan las enzimas?? Modelo llave-cerradura Sitio activo Modelo inducido Sitio activo Estado de transición (ES)

Ejemplo: REACCION CATALIZADA POR LA HEXOQUINASA D-Glucosa

Factores que afectan la actividad enzimática Concentración de Sustrato Concentración de Enzima pH Temperatura

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL Velocidad inicial (vo) [S]

Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad Concentración saturante de sustrato, pH y temp. constantes

Influencia del pH sobre la actividad enzimática

Ejemplos de enzimas con diferentes pH óptimo

Influencia de la Temperatura sobre la actividad enzimática actividad por de la temperatura T(ºC) Actividad enzimática T. óptima de temperatura provoca desnaturalización

ISOENZIMAS Diferentes formas moleculares de una misma enzima. Son sintetizadas por genes diferentes Tienen diferente composición aminoacídica por lo que pueden separarse por electroforesis. Catalizan la misma reacción, actuando sobre el mismo sustrato para dar el mismo producto

Dos isoenzimas presentan en general diferentes valores de Km y Vmáx. Se encuentran ubicadas en diferentes compartimentos de la célula ó en diferentes tejidos. Son utilizadas en clínica para determinar el origen del tejido dañado

Lactato deshidrogenasa (LDH) Presenta 5 isoenzimas con distinta composición en cuanto a sus subunidades y c/u es específica de un tejido. H4 H3M H2M2 HM3 M4 M > Músculo H > Corazón

Ejemplo de isoenzima: Glucoquinasa y hexoquinasa Actividad enzimática Km. hexq Km. glucq [glucosa mmol/l

Energía de activación de una Reacción catalizada y una reacción no catalizada REACCION NO CATALIZADA REACCION CATALIZADA

Diagrama de coordenadas de una reacción enzimática catalizada y sin catalizar P (*) DG* cat ∆G* reacción no catalizada S Energía Libre (G) Estado de transición Progreso de la reacción ES EP

Relación entre velocidad y concentración de sustrato E + S ES E + P k1 k2 k-1 [E]t = [E] + [ES] v o= k2[ES] Concentración saturante de sustrato [S] >>> [E] Medida de velocidad inicial Paso limitante: Descomposición de ES

ESTADO ESTACIONARIO E + S ES E + P k1 k2 k-1 V. de Formación de ES = k1 ( [Et ] –[ ES ] ) [S] V. de Descomp.de ES = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ] ESTADO ESTACIONARIO k1 ( [Et ] – [ ES ] ) [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ] v o= k2[ES] Km = (k-1 + k2)/k1 Vmáx = k2 [Et]

Representación de la ecuación de Michaelis - Menten Vo [S]

Km se considera una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato SIGNIFICADO DE Km E + S ES E + P k1 k2 k-1 Km = (k-1 + k2)/k1 k2<<< k-1 Km = k-1 /k1 Km =Ks Km se considera una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato

Constante de velocidad del paso limitante SIGNIFICADO DE Vmáx E + S ES E + P k1 k2 k-1 E + S ES EP k2 k1 k3 P k-1 k-2 [Et] = [E] + [ES] Vmáx = k2 [Et] No siempre el paso limitante de la velocidad está dado por k2 Constante de velocidad del paso limitante Vmáx = k3 [Et] kcat Vmáx = kcat [Et] Número de recambio (t-1)

Eficiencia catalítica de una enzima                                     Eficiencia catalítica de una enzima Vmáx = kcat [Et] CUANDO [S] <<<< Km La velocidad depende de la concentración de enzima total y de la concentración de sustrato kcat/Km es una constante de velocidad y es el mejor parámetro para conocer la eficiencia catalítica de una enzima

GRÁFICA DOBLE RECÍPROCA O DE LINEWEAVER-BURK Ordenada al origen = 1/Vmáx. Pendiente= Km/Vmáx Intersección c/eje x = - 1/Km

INHIBICION ENZIMATICA COMPETITIVA NO COMPETITIVA ACOMPETITIVA INHIBICION REVERSIBLE POR ENLACE COVALENTE (Análogos del estado de transición) INHIBIDOR SUICIDA DIFP Quimotripsina INHIBICION IRREVERSIBLE Penicilina Transpeptidasa Alopurinol Xantina oxidasa

INHIBICION REVERSIBLE INHIBICION COMPETITIVA E E + S ES E + P I EI I + [E] [I] [EI] Ki = S     KM ap = Km(1 + [I]/Ki)

Ejemplo de Inhibidor competitivo Succinato + FADH2 Fumarato + FAD+ Succinato deshidrogenasa COO- (CH2)2 COO- CH2 Succinato Malonato

v Gráfica de M-M Km Km ap [S] 1/v Gráfica de L-B 1/[S] -1/Km -1/Kmap

INHIBICION NO COMPETITIVA S E + S ES E + P + I EI + I ESI I E S I + S

Km [S] v Gráfica de M-M -1/Km 1/[S] 1/v Gráfica de L-B Vmáx ap.= Vmax.s/I      Km(1 + [I]/Ki)

INHIBICION ACOMPETITIVA E + S ES E + P + I ESI E S E S I

Inhibición acompetitiva 1/[S] 1/ Vmáx C/ Inhibidor S/ Inhibidor 1/Vmax. Inh. 1/Vmax. s/Inh. -1/Km c/inh -1/Km s/inh

Características de los diferentes tipos de inhibición reversible Tipo de El Inhibidor Efecto Efecto inhibición se une a s/Vmáx s/Km Competitiva E Ninguno Aumenta No competitiva E y ES Disminuye Ninguno Acompetitiva ES Disminuye Disminuye Kma c/I. = Km s/Inh. (1+ [I]/Ki) Vmáx c/I= Vmáx. s/Inh. / 1 + [I]/ Ki

Acción de inhibidores a distinta concentración COMPETITIVA NO COMPETITIVA Pendiente = Km / Vmáx

INHIBICION IRREVERSIBLE . Por unión covalente del inhibidor - Acetilcolinesterasa - Quimotripsina Enzima inactivada Diisopropilfluorfosfato (DFP)

INHIBICION IRREVERSIBLE . Inhibidor suicida Se une al sitio activo de la enzima y ésta cataliza la modificación del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima. El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que actúa sobre la enzima xantina oxidasa (degradación de purinas). Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.

REGULACION DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ENZIMAS ALOSTERICAS REGULACION POR PROTEINAS REGULACION POR PROTEOLISIS REGULACION COVALENTE ENZIMAS INDUCIBLES REGULACION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS

MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS ENZIMAS ALOSTERICAS Enzima 1 2 3 4 Enzima 1 ENZIMA ALOSTERICA MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

Bifurcación de una vía metabolica

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS ALOSTERICAS Poseen un sitio de unión a un metabolito regulador (sitio alostérico) La unión del metabolito a la enzima es de carácter reversible y no covalente. Son homotrópicas o heterotrópicas. En general poseen dos o mas sitios reguladores. La mayoría posee dos o mas cadenas polipeptídicas o subunidades. En general tienen un comportamiento cinético sigmoideo

CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTERICA Curva Sigmoidea

Regulación de la actividad de la Aspartato transcarbamilasa (ATCasa) Aspartato (mM)

EJEMPLOS DE ENZIMAS ALOSTERICAS Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato Quinasa Vía glicolítica AcetilCoA carboxilasa Biosíntesis de lípidos Aspartato Transcarbamilasa Biosíntesis de nucleó tidos pirimidínicos Glutamato Deshidrogenasa Degradación de aminoácidos Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato deshidrogenasas Ciclo de Krebs

ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCasa) Dominio carbamil fosfato Dominio aspartato Dominio Zinc Dominio alostérico Dominio carbamil fosfato

REGULACION POR MODIFICACION COVALENTE Enzima Enzima Enzima Enzima Fosforilacion Fosfoadenilacion Enzima Enzima ADP-Ribosilación

Ejemplo de regulación covalente Fosforilasa fosfatasa 2 Pi 2 H2O Fosforilasa quinasa ATP ADP Fosforilasa b P -O-CH2 CH2- O- P Fosforilasa a (menos activa) (Cadena lateral de Ser) CH2- HO HO-CH2

REGULACION POR PROTEOLISIS Por eliminación de una cadena peptídica, enzimas inactivas se convierten en enzimas activas y viceversa. Las enzimas digestivas: pepsinógeno y quimotripsinógeno se convierten en las enzimas activas pepsina y tripsina. Suele ocurrir una activación secuencial produciéndose una cascada de activaciones. Ej. Coagulación sanguínea. ZIMOGENOS

REGULACION POR PROTEINAS Modifican la actividad de enzimas involucradas en el metabolismo celular. Por ej. Indirectamente activando o inhibiendo la actividad de la glutamina sintetasa. RNA polimerasa: Asn, Gln, Glu, Lys y Arg forman enlaces hidrógenos con las bases del DNA