TERAPIA GÉNICA LIDA INÉS MANCILLA E.

CONCEPTO DE TERAPIA GÉNICA Modificación de la dotación genética de una célula mediante la introducción de un gen normal en el organismo diana que sustituya al gen defectuoso en su función. El conjunto de técnicas que permiten vehiculizar secuencias de ADN o de ARN al interior de células diana, con objeto de modular la expresión de determinadas proteínas que se encuentran alteradas, revirtiendo así el trastorno biológico que ello produce.

Nuevo concepto de Terapia génica Terapia génica (TG) es la parte de la terapéutica que utiliza material genético en el tratamiento de enfermedades; intenta modular la función celular, pudiendo corregir la deficiencia causada por la pérdida o alteración de un gen al modificar la expresión de proteínas

http://www.japi.org/february_2013/06_ra_human_gene_therapy_a.pdf

MODALIDADES DE TERAPIA GÉNICA: En función del tipo celular diana Terapia génica de células germinales Dirigida a modificar la dotación genética de las células implicadas en la formación de óvulos y espermatozoides. Transmisible a la descendencia Terapia génica somática Dirigida a modificar la dotación genética de células somáticas o constituyentes del organismo. Modificación genética no puede transmitirse a la descendencia

TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS GERMINALES Ventajas Indicada para corregir de forma definitiva las enfermedades congénitas Desventajas La terapia génica de la línea germinal humana no ha sido practicada. Limitaciones de la tecnología . Consideraciones éticas Modificación del acervo genético de la especie humana Riesgo de potenciación genética

TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS Por consenso general entre los investigadores y con la legislación actual, basada en motivos éticos y de seguridad, solamente se llevan a cabo protocolos clínicos en este tipo de terapia génica. Aplicación con el solo objetivo de tratar enfermedades. Modificación del acervo genético de la especie humana Riesgo de potenciación genética

TIPOS DE TERAPIA GÉNCIA En Función de la estrategia aplicada Terapia génica in vivo Agrupa la técnicas en las que el material genético se introduce directamente en las células del organismo, sin que se produzca su extracción ni manipulación in vitro. Ventaja: Técnica más sencilla que la técnica in vitro Menor grado de control sobre todo el proceso de transferencia. La eficiencia global es también menor (dado que no pueden amplificarse las células transducidas) Difícil conseguir un alto grado de especificidad tisular. Desventajas:

http://www.nature.com/nm/journal/v21/n2/fig_tab/nm.3793_F3.html

TIPOS DE TERAPIA GÉNCIA En Función de la estrategia aplicada Terapia génica ex vivo Las células a tratar son extraídas del paciente, aisladas, crecidas en cultivo y sometidas al proceso de transferencia in vitro. Las células que han sido efectivamente transducidas, se expanden en cultivo y se introducen de nuevo en el paciente. Permitir la elección del tipo de célula a tratar Mantener un estrecho control sobre todo el proceso Mayor eficacia de la transducción genética Evaluación de los efectos de la integración en los cromosomas Ventajas: Desventajas: Mayor complejidad y coste de los protocolos. Imposibilidad de transducir aquellos tejidos que no son susceptibles de crecer en cultivo Problemas de contaminación de células por manipulación.

TERAPIA GÉNICA EX VIVO http://www.nature.com/nm/journal/v21/n2/fig_tab/nm.3793_F3.html

https://www. scienceopen https://www.scienceopen.com/document/vid/4f8c3c2b-7491-4ff4-96fd-0e8fac1177a4

MECANISMOS DE MODIFICACIÓN DEL GEN Aumento de expresión Reemplazo del gen Blancos para destrucción de células especificas Blancos para inhibición de expresión génica

http://slideplayer.com/slide/8427791/

TRANSFERENCIA GÉNICA La principal condición para la eficacia de la terapia génica es la Expresión en cantidad adecuada de los genes transferidos Mecanismo de transferencia génica Integración en los cromosomas de la célula Permanecer como elementos genéticos extracromosómicos (episomas)

GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS Puede perpetuarse por replicación cromosómica tras la división celular. Como las células de la progenie también contienen los genes introducidos, se puede obtener una expresión estable a largo plazo La modificación se realiza en las células madre: con capacidad de diferenciarse en tejido. También se renuevan ellas mismas. La transferencia eficiente de genes a las células madre y la posterior estable expresión del gen ofrece, por tanto, la posibilidad de curar un trastorno genético.

GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS Posibles Eventos de la integración Consecuencias La inserción en el cromosoma es al azar la localización de los genes insertados puede variar enormemente entre células. inserción en regiones muy condensadas= no hay expresión Modificación de genes vitales Provocar la muerte de la célula hospedera (únicamente la célula transformada): Perturbar los patrones de expresión de genes que controlan la división o la proliferación celular Elevado riesgo de cáncer

Riesgo de cáncer elevado en la terapia génica Por activación de un oncogén Inactivación de un gen supresor de tumores Gen implicado en la apoptosis http://veryshareimg.com/oncogene-and-tumor-suppressor-genes.html

GENES NO INTEGRADOS Se inserta los genes en células donde pueden quedar como elementos extracromosómicos (episomas) Hay expresión elevada del gen El gen introducido no necesariamente segrega igualmente a las células hijas Se puede perder la expresión a largo plazo Se requieren tratamientos repetidos de terapia génica. Transferencia y expresión de genes a células cancerosas es temporal El gen terapéutico es útil solo hasta la eliminación de las células cancerosas Útil en las terapias génicas contra el cáncer

Métodos de transferencia génica Concepto de Transferencia génica: transducción o transfección. Es la introducción en una célula de material genómico foráneo Requisitos para lograr un efecto biológico adecuado: Introducir correctamente la secuencia en la célula Lograr la expresión del gen Se requiere: Adecuado sistema de vehiculización o transferencia Promotores adecuados para conseguir la máxima expresión del gen insertado en la célula

Métodos de transferencia génica FÍSICO-QUÍMICOS Los métodos de transferencia génica físico-químicos o no virales El ADN foráneo o exógeno está integrado en un plásmido Molécula estable e independiente del genoma de la célula hospedera. ventajas: Sencillos de preparar, lo que permite su producción de forma industrial; no tienen limitaciones en cuanto al tamaño del ADN que pueden transferir son poco tóxicos no son inmunogénicos http://oaji.net/articles/2014/38-1393929615.pdf

Métodos de transferencia génica físico-químicos o no virales Microinyección Precipitación con fosfato cálcico Electroporación Bombardeo con microproyectiles Inyección directa de ADN “desnudo” Conjugados ADN-proteínas Conjugados ADN-adenovirus Liposomas Desventajas: Con baja eficacia de transducción de las células diana Algunos de ellos sólo pueden utilizarse in vitro

Transferencia mediada por virus Más eficaz Vectores más utilizados en terapia génica. Se sustituyen ciertos genes prescindibles del vector por los genes de interés Región con gen de interés (inserción o cassette) Su tamaño (número de kilobases: kb) depende del tamaño del virus y de los genes que puedan ser sustituidos El tamaño del gen es un factor limitante

VECTORES VIRALES DE TRANSFERENCIA GÉNICA Adenovirus Virus adenoasociados Virus vaccinia Herpesvirus Retrovirus Eliminación de uno o más genes indispensables para la replicación del virus, Sustitución por el gen terapéutico. Nuevo virus es defectivo: mantiene la capacidad de infectar las células pero es incapaz de multiplicarse en ellas.

Tipos de vectores virales empleados en Terapia génica (Gene targeting)

http://www.nature.com/nrc/journal/v2/n6/fig_tab/nrc823_F2.html

Expresión de genes con vectores virales

VECTORES VIRALES DE TRANSFERENCIA GÉNICA Ventajas: Elevada eficacia de transfección (Hasta del 100%) Desventajas: Problemas de seguridad: Transferencia del virus nativo patógeno Recombinación con genoma de la célula: Modificación del genoma celular (activar oncogenes o inactivar un supresor de tumores) Reactivación del virus ( adquirir patogenicidad) Reacción inmunitaria (activada por antígenos virales) Eliminación del gen foráneo a través de la muerte de células transfectadas

MARCAJE CELULAR Consiste en introducir ,junto con el gen terapéutico, uno o más genes que permitirán identificar y seleccionar aquellas células diana que hayan incorporado el transgén. Ejemplo: Gen que confiere resistencia a neomicina permite la detección selectiva de las células en medio selectivo Doble marcaje: Un gen foráneo (Ej, resistencia a neomicina): Selección in vitro de células transfectadas Otro gen (Ej, enzima timidina cinasa del virus del herpes simplex): Selección negativa in vivo (Ganciclovir. Permite eliminar las células modificadas si se requiere

TIPOS DE MODIFICACIONES TERAPEUTICAS DEL GENOMA http://www.nature.com/nm/journal/v21/n2/fig_tab/nm.3793_F1.html

http://www.nature.com/nm/journal/v21/n2/fig_tab/nm.3793_F1.html

TERAPIA ANTISENTIDO Se aplica a secuencias cortas de ADN o ARN (oligonucleótidos) diseñadas para ser complementarias de secuencias génicas específicas, con el fin de interferir el flujo de información genética. Inhiben la síntesis proteica al interferir los procesos de transcripción y/o traducción. Existen tres clases principales: Ribozimas: Secuencias antisentido (oligonucleótidos): ARN antisentido con capacidad de catalizar enzimáticamente la hidrólisis de secuencias específicas de ARNm. Reconocen específicamente diversas secuencias de ARN diana. derivan de ácidos nucleicos que se unen (hibridan) con hebras de ARNm citosólicas – Secuencias antigén Se hibridan al ADN de doble hebra localizado en el núcleo Crean secuencias en triple hélice que bloquean la transcripción del gen correspondiente (directamente o interfiriendo en la unión de proteínas a secuencias específicas del ADN)

ENFOQUES DE LA TERAPIA ANTISENTIDO Administración directa de oligonucleótido Microinyección directa, Complejos con lípidos con carga positiva Liposomas y la electroporación. Expresión de los oligonucleótidos tras la transfección de determinadas células. vectores como adenovirus o retrovirus El vector es administrado al paciente, Las células serán las encargadas de generar el oligonucleótido antisentido

La expresión de oligonucleótidos Ventajas Interferir en el transporte del ARNm al citoplasma inducir una actividad nuclear del tipo ribonucleasa H interferir en el proceso de transcripción de la hebra de ADN complementaria; los ARN antisentido expresados son de mayor longitud, lo que ofrece más posibilidades de interacción con el ARNm diana, Favorecer la formación de interacciones no específicas Facilitar la formación de estructuras secundarias que interfieran en el proceso de hibridación.

APLICACIONES DE LA TERAPIA GÉNICA TERAPIA GÉNICA DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS TERAPIA GÉNICA DE CÁNCER TERAPIA GÉNICA DE LA INFECCIÓN POR VIH

A principios del año 2000, investigadores franceses pusieron a punto con éxito un método de TG que trata la inmunodeficiencia combinada grave X-1 en el hombre. Dos lactantes de 8 y 11 meses recibieron una copia normal del gen defectuoso y, tras once meses desde su aplicación, los bebés presentaron un sistema inmunitario normal y sin efectos secundarios.

ENFERMEDADES MONOGÉNICAS EN LAS QUE SE APLICA PROTOCOLO DE TERAPIA GÉNICA

Rozalem J et al. OFFARM 22:10, 2003

© JAPI • february 2013 • VOL. 61 http://www.japi.org/february_2013/06_ra_human_gene_therapy_a.pdf

TERAPIA GÉNICA DE CÁNCER Utilizar la manipulación génica para dotar de una nueva propiedad a las células, que permite aprovecharlas en algún aspecto de la patología oncológica con fines terapéuticos. Mama, Ovario, Cabeza y cuello, Pulmón Próstata, Células renales Tumor cerebral, Leucemia mieloide aguda, Leucemia mieloide crónica Linfomas, Melanoma, Mieloma múltiple Neuroblastoma Tipos de cáncer tratados con terapia génica https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/genesandgenetherapy.html

Ramón y Cajal & Sánchez-Prieto Ramón y Cajal & Sánchez-Prieto. Terapia génica en procesos tumorales en Clonación y trasplantes Capitulo 9.

Ramón y Cajal & Sánchez-Prieto Ramón y Cajal & Sánchez-Prieto. Terapia génica en procesos tumorales en Clonación y trasplantes Capitulo 9. 2002

TERAPIA GÉNICA DE INFECCIÓN POR VIH Estrategias aplicadas en ensayos clínicos de terapia génica contra VIH Transferir un gen del virus VIH: – Introducir genes de inhibidores celulares de la replicación vírica (interferón-a) en líneas celulares de linfocitos T y monocitos Transferir genes de proteínas mutantes del VIH Secuestrar proteínas víricas reguladoras mediante señuelos de ARN, sobreexpresados en la célula a partir de genes transferidos – Oligonucleótidos antisentido, complementarias de las secuencias genéticas del VIH Manejo de ribozimas,que son ARN con propiedades catalíticas. Introducción en las células diana de genes que codifican anticuerpos de cadena única frente a proteínas del VIH