"Bioquímica del estrés oxidativo en Vegetales"

Presentación del tema: ""Bioquímica del estrés oxidativo en Vegetales""— Transcripción de la presentación:

1 "Bioquímica del estrés oxidativo en Vegetales"
Curso Optativo para Lic. en Bioquímica Lic. en Biología Molecular

2 TEMA 1 ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO
TEMA 2: ENZIMAS ANTIOXIDANTES TEMA 3:SUSTANCIAS ANTIOXIDANTES

3 En la naturaleza todo es oxidado por el oxígeno.

4 La principal fuente de origen de los radicales libres es la respiración, ya que entre un 1 a 3% del oxígeno consumido se transforma en radicales libres.

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7 FORMAS QUIMICAS DE LAS ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO
RADICAL LIBRE HO. ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO (EROS) e- Desapareado NO RADICAL O2- Reducciones parciales H2O2 O2 e- Desapareado X

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10 PROPIEDADES GENERALES DE LAS EROS
HO. 10-3 ms ALTAMENTE REACTIVO Es la especie más fuertemente oxidante Afecta al ADN, proteínas, lípidos. Sustrae protones; Se une a dobles enlaces (por ej. Ac. Grasos insaturados) Radical hidroxilo O2.- 2-4 ms ACTUA COMO OXIDANTE O REDUCTOR DISMUTA A H2O2 No puede atravesar las membranas Reduce metales de transición Radical superóxido

11 O2- H2O2 1 ms Transfiere su En de excitación a otras moléculas o
4 ms en agua 100 ms Transfiere su En de excitación a otras moléculas o Forma endoperóxidos ó hidroperóxidos Oxígeno singulete H2O2 ES MODERADAMENTE REACTIVO En presencia de metales forma el radical hidroxilo Oxida grupos tioles de proteínas 1 ms Peróxido de hidrógeno

12 La alta inestabilidad electrónica de las EAO les hace colisionar con las biomoléculas, les sustraen un electrón y las oxidan. Esto provoca un cambio estructural en la molécula que la lleva a perder la función biológica específica que desempeñaba en la célula.

13 GENERACIÓN DE RADICAL SUPERÓXIDO (O2.-)
ORIGEN No enzimático Enzimático Metales de transición Xantina y aldehído oxidasa Tioles, quinonas, flavinas Citocromo P-450 Hemo-, mioglobina NADPH oxidasa

14 GENERACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (H2O2)
Origen: a) Dismutación del superóxido (espontánea o catalizada por SOD) b) Reducción enzimática de O2 2 O H H2O O2 O e- + 2 H H2O2

15 GENERACIÓN DE RADICAL HIDROXILO (HO.)
- Reacción de Haber-Weiss - Reacción de Fenton O H2O HO. + HO- + O2 Fe2+ + H2O Fe3+ + HO. + HO- Fe3+ + O Fe2+ + O2 O2

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17 SITIOS DE PRODUCCION DE EROS EN PLANTAS
Cloroplastos: A nivel de los fotosistemas I (PSI) y II (PSII) Mitocondria: Durante el transporte electrónico Microsomas: Complejo citocromo P-450 Peroxisomas: Oxidación de glicolato en el carbono 2. Oxidación de ácidos grasos(Flavoproteína-AcilCoA Oxidasa) Glioxisomas: oxidación de ácidos grasos. (Flavoproteína-AcilCoA Oxidasa) Membrana: Peroxidación de lípidos y acción de la NADPH oxidasa. Pared celular: peroxidasas y oxidasas Apoplasto: aminooxidasas participan en la formación de H2O2 Espacio extracelular: Oxalato oxidasa (H2O2 + CO2)

18 ¿Dónde se producen las EAO?
Sitios de producción de EAO en el sistema de transporte electrónico del cloroplasto

19 Sitios de formación de Superóxido en el sistema de transporte electrónico mitocondrial
Oxidasa alternativa

20 RETICULO ENDOPLASMICO (Microsomas)
OXIGENASAS DE FUNCION MIXTA NADPH agente reductor RH + NADPH + H+ + O ROH + NADP+ + H2O RH-P R•-P450 R•-P O P450-RHOO ó P450-ROO• P450-ROO• O RH-P450 P450-ROO• P RHOO

21 PARED CELULAR MEMBRANA
DIAMINOOXIDASAS (ROS) NAD/NADP-OXIDASAS (H2O2) Reacciones dependientes de H2O2 Defensa contra patógenos Degradación de xenobióticos Síntesis de lignina Aminas biógenas NH3 + H2O2 + Aldehídos MEMBRANA NADPH oxidasa (NOX)

22 Glioxisomas y peroxisomas
Los glioxisomas son organelas con una membrana simple que compartimentalizan enzimas involucradas en la -oxidación de ácidos grasos y en el ciclo del ácido glioxílico. En los peroxisomas se encuentran catalasas, peroxidasas, xantina oxidasa y glicolato oxidasa. La glicolato oxidasa produce H2O2 en dos transferencias de electrones desde el glicolato al oxígeno. Xantino oxidasa, urato oxidasa y las NADH oxidasas generan superóxido como una consecuencia de la oxidación de sus sustratos.

23 PRODUCCION DE EROS FACTORES ABIOTICOS FACTORES BIOTICOS Sequía
Altas temperaturas Fuentes de Radiacion Concentración salina Condiciones pH extremas FACTORES AMBIENTALES PATOGENOS Insectos Virus Bacterias

24 EROS FUENTES EXOGENAS BIOTICOS O ABIOTICOS PRODUCCIÓN DE ROS
FUENTES ENDOGENAS METABOLISMO CELULAR ESTRÉS OXIDATIVO EROS

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34 MECANISMOS DE DEFENSA ENZIMATICOS
PEROXIDOS Ascorbato peroxidasa Superóxido dismutasa Glutatión peroxidasa Catalasa RADICAL SUPEROXIDO PEROXIDOS PEROXIDO DE HIDROGENO

35 Ascorbato peroxidasa EC 1.6.5.4
H2O2 Sustratos ACIDO ASCORBICO H2O2 + AsA H2O + MDHA MDHA MDHA reductasa NADPH NADP+ AsA + DHA AC. ASCORBICO DHA reductasa GSSG 2 GSH

36 ISOENZIMAS DE APX Estroma (sAPX) Tilacoides (tAPX) Microcuerpos (mAPX)
Citosol (cAPX) Mitocondria (mitAPX) Cloroplastos (chlAPX) TIENEN ALTA ESPECIFICIDAD POR EL ACIDO ASCORBICO (-) Cianuro, azida, reactivo con grupos tioles (p-cloromercuribenzoato) (-) inhibidores suicidas: hidroxilamina, p-aminofenol e hidroxiurea. Son sensibles al estrés fotooxidativo Regulación de actividad, síntesis y post-transcripcional

37 Superóxido dismutasa Son metaloenzimas que eliminan los radicales superóxidos (O2.-) RADICAL SUPEROXIDO SUSTRATO 2 O H O H2O2 Enz-Cu O Enz-Cu O2 Enz-Cu O H3O Enz-Cu H2O2

38 ISOENZIMAS DE LA SOD Isoenzima I: FeSOD Cloroplastos
Isoenzima II: MnSOD Mitocondrias y peroxisomas Isoenzima III: Cu-Zn SOD Cloroplastos, citosol y espacio extracelular. ( - ) H2O2 homodímero /tetrámero homodímero /tetrámero homodímero /tetrámero Los genes SOD se regulan diferencialmente a través del desarrollo y en respuesta a varias condiciones de estrés.

39 Catalasa Es una hemoproteína
Tetrámero con cuatro subunidades idénticas Se encuentran en peroxisomas y glioxisomas. No requieren de un sustrato reductor 2 H2O H2O + O2 H2O2 + Fe (III)-E H2O O=Fe(IV)-E H2O2 + O=Fe(IV)-E H2O O Fe (III)-E

40 PAPEL BIFUNCIONAL DE LA CATALASA
Elimina el peróxido de hidrógeno Forma peróxidos a partir de una molécula orgánica Reacción de dismutación Reacción de Peroxidación

41 CLASIFICACION Subgrupo I: Catalasa verdadera ó típica.
Subgrupo II: Catalasa-peroxidasa (eucariotas de hongos) Subgrupo III: Catalasa atípica. (no hemínica, Mn)

42 REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE CATALASA
El Acido salicílico o sustancias similares regulan la actividad de catalasa Tejidos sanos [H2O2] AS CATALASA Tejidos cercanos a celulas necróticas [H2O2] AS Donor de e- En tabaco el óxido nítrico inhibe la enzima

43 FUNCION DE LA CATALASA EN EL ESTRÉS
Nicotiana plumbaginifolia (C3) Sistema fotorespiratorio Estrés oxidativo b-oxidación de los ácidos grasos en los glioxisomas gen Cat1 gen Cat2 gen Cat3 Plantas de tabaco Exposición luz lesiones necróticas en las hojas. CATALASA

44 GLUTATION REDUCTASA FLAVOPROTEÍNA HOMODIMÉRICA
G-S-S-G NADPH H+ 2 GSH NADP+ Glutatión Glutatión Oxidado reducido FLAVOPROTEÍNA HOMODIMÉRICA

45 ISOENZIMAS DE GLUTATION REDUCTASA
CLOROPLASTOS CITOSOL PRODUCTO DE DIFERENTES GENES MITOCONDRIA Secuencias Regulación Respuestas a señales ambientales diferentes.

46 Glutatión peroxidasa No es una enzima constitutiva.
2 GSH R-OOH GSSG H2O ROH No es una enzima constitutiva. Inducida en respuesta al estrés. Es mas importante en la remoción de peróxidos de lípidos y alquilos.

47 MECANISMOS DE DEFENSA NO ENZIMATICOS
ACIDO ASCORBICO GLUTATION TOCOFEROL CAROTENOIDES FITOQUELATINAS POLIAMINAS FLAVONOIDES

48 Propiedades del Acido ascórbico
Antioxidante (citoplasma, cloroplastos, vacuolas) Muy reactivo (recolector de radicales libres: O2.-, H2O2). Estabiliza el radical hidroxilo Evita la peroxidación lipídica Regenera la vitamina E Importante para el crecimiento, diferenciación celular y el metabolismo. FUENTES DE ACIDO ASCORBICO: Grosella, pimiento verde, kiwi, limón, coliflor, naranja, tomate y melón

49 BIOSINTESIS DE ACIDO ASCORBICO (CITOSOL)
D-GLUCOSA D-MANOSA D-GALACTOSA L.GALACTOSA L-GALACTO-1,4-LACTONA Membrana Interna Mitocondrial L-galacto-1,4 deshidrogenasa (EC ) ACIDO ASCORBICO Transportador específico (Km AA 90 uM y Km DHA = 20 uM)

50 Determinación VIT C (Acido Ascórbico)
1)Por la oxidación de acido ascórbico con el reactivo 2,6-diclorofenol indofenol 2) Acido ascórbico: Formación del complejo entre Fe2+ y bipiridil después de una reducción de Fe3+; l 525 nm. Acido Ascórbico total: Reducción de ascorbato oxidado, l 500 nm

51 MONODEHIDROASCORBATO
ACIDO ASCORBICO Superóxido Peróxido de hidrógeno Radical tocoferilo Reductasa MONODEHIDROASCORBATO GSSG Reductasa 2GSH DEHIDROASCORBATO Tartrato + oxalato

52 EL GLUTATION ES EL MAYOR RESERVORIO DE AZUFRE NO PROTEICO
NH3 O O -OOC-CH-CH2-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH2-COO CH2 SH g-Glutamato Glicina Cisteína GLUTATION REDUCIDO + ו װ GLUTATION Oxidado Glu-Cys-Gli │ EL GLUTATION ES EL MAYOR RESERVORIO DE AZUFRE NO PROTEICO

53 PROPIEDADES DEL GLUTATION
Protege las proteínas de la oxidación del grupo tiol. Detoxificador por conjugación con algunos herbicidas. Está presente en la mayoría de los células y compartimentos subcelulares. Mayor nivel en cloroplastos. Reduce el DHA a ascorbato. Es recolector de radicales libres. Estabiliza las membranas (remueve peróxidos).

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56 TOCOFEROL (Vit E) Hidrofóbico (unido a membranas)
Posee un anillo benzoquinona y una cadena fitilo Secuestrante de O2 y peróxidos Evita la propagación de las reacciones de peroxidación Maíz tolerante al frío: >> tocoferoles y glutatión. El Ascorbato regenera tocoferol

57 MODO DE ACCION DEL a-TOCOFEROL

58 CAROTENOIDES Flia. de Isoprenoides y tetraterpenos (Carotenos y Xantófilas) Unidos a membranas (Oxígeno singulete) Cloroplastos (ROS) Plastidios (tejidos fotosin. y no fotosintéticos) Clorofila Triplete: Caroteno evita formación ´O2 singulete Zeaxantina Disipa la energía de la clorofila excitada

59 En término de sus propiedades antioxidantes, los carotenoides, pueden proteger los fotosistemas por 4 vías: Por reacción con productos de lipoperoxidación al terminar las reacciones en cadena. Por el reclutamiento de oxígeno singulete y disipación de la energía como calor. Por reacción con moléculas de clorofila triplete o excitadas para prevenir la formación de oxígeno singulete. - Por la disipación de exceso de energía de excitación a través del ciclo de las xantofilas.

60 POLIAMINAS Son pequeñas aminas alifáticas y se clasifican como diaminas y poliaminas propiamente dichas. Son moléculas básicas cargadas positivamente al pH fisiológico. Se unen a moléculas con cargas negativas, como por ejemplo ácidos nucleicos, fosfolípidos y varias proteínas. Las poliaminas aparecen en las plantas de manera libre o conjugada a pequeñas moléculas. Están implicadas en la regulación de la senescencia y morfogénesis y quizás su principal función es responder a diferentes estreses en plantas. La oxidación de las diaminas o poliaminas por las diamino- y poliaminoxidasas respectivamente, producen altos niveles de H2O2 que causan la muerte de la célula vegetal, o crean un halo que limita la entrada del hongo o virus y por otro lado ataca directamente al virus u hongo.