Estructura y propiedades de los canales de iones Martes 17 de abril: 14.30-17.30 ftp://einstein.ciencias.uchile.cl/ CursoTroncal2007.

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1 Estructura y propiedades de los canales de iones Martes 17 de abril: 14.30-17.30 ftp://einstein.ciencias.uchile.cl/ CursoTroncal2007

2 Canales de iones de las membranas excitables Hodgkin y Huxley 1952

3 Axón de jibia Electrodo que inyecta corriente Electrodos para medir el potencial Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón. V x (t)

4 Estímulo en de 25 microamperes en x = 0. Dura 0,5 milisegundos y empieza a t = 0 milisegundo. Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio. 0.00 ms

5 0.04 ms0.12 ms0.52 ms1.24 ms1.88 ms2.28 ms2.92 ms3.72 ms4.60 ms5.48 ms6.44 ms8.04 ms8.84 ms9.80 ms10.76 ms15.12 ms

6 -60 mV 0 mV Medio extracelular Medio intracelular Potencial eléctrico intracelular, axón de jibia

7 [K] 440mM [Na] 50mM [Na] 440mM[K] 10mM Análisis cuantitativo de Na y K en axones gigantes de jibia. Medio extracelular Medio intracelular

8 -60 mV [Na] 50mM [Na] 440mM0 mV Potencial químico del sodio

9 -60 mV [Na] 50mM [Na] 440mM Potencial químico del sodio R = 8.3 J mol -1 K -1 T = 293 K z = 1 F = 95600 C mol -1

10 [K] 440mM [K] 10mM -60 mV Potencial químico del potasio

11 ¿Qué pasará si abro una vía de paso para los iones Na + ? -60 mV [Na] 50mM [Na] 440mM Debe existir un potencial eléctrico al cual el sodio esté en equilibrio. Condición de equilibrio ?

12 Unidades? JC -1 Ecuación de Nernst

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14 054-94 Corriente de entrada de Na Corriente de salida de Na Corriente de entrada de K Corriente de salida de K V m, mV -60

15 Conductancia, G, se mide en Siemens, S

16 Electrodo que inyecta corriente Vm (t) Electrodo que mide potencial intracelular Electrodo que mide el potencial extracelular A todo lo largo del axón pasa exactamente lo mismo (Space clamp). El potencial de acción no se propaga. Se llama potencial de acción de membrana. Space clamp

17 Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) V Na VKVK ImIm VmVm Im, (mAcm -2 )

18 Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp) V comando El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad. Voltage clamp VmVm

19 Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp) El potencial de la membrana es igual al comando. El ampérmetro A mide la corriente que pasa por 1 cm lineal de axolema. A Voltage clamp V comando VmVm

20 I, mA/cm 2 t, ms Voltage clamp de un axón de jibia -60,8mV 0mV Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol (London) 117:500-544 Latorre et al Biofísica y Fisiología Celular. Sevilla,1996

21 I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na La conductancia del K + es función del potencial y del tiempo

22 I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX. La conductancia del Na + es función del potencial y del tiempo

23 Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) Im, (mAcm -2 ) Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol (London) 117:500-544

24 Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) Im, (mAcm -2 ) Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol (London) 117:500-544

25 Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) I Na, (mAcm -2 ) Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol (London) 117:500-544

26 Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) I K, (mAcm -2 ) Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol (London) 117:500-544

27 Los canales responsables del potencial de acción en el axón gigante de jibia tienen dos atributos importantes. Selectividad. Conducen Na o K en forma excluyente. Excitabilidad. Capacidad de cambiar su capacidad de conducir iones en función del voltaje.

28 Selectividad de los canales

29 Movimiento en un medio viscoso Velocidad = movilidad · fuerza (m s -1 ) La “fuerza” que impulsa el movimiento de los iones es su gradiante de potencial químico. J mol -1 m -1 movilidad = velocidad por unidad de fuerza ( ms -1 N -1 mol) N mol -1 velocidad = movilidad · fuerza (m s -1 )

30 Esta caja es un elemento de volumen de un sistema más grande. En la caja hay moléculas que se están moviendo impulsadas por un gradiente de potencial químico. La velocidad de las moléculas es v ms -1 Todas las moléculas que están a una distancia v  t atraviesan la pared de la izquierda en un tiempo  t v vtvt A Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t +  t. El número de moles del soluto presente en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v  t. c

31 Todas las moléculas que están a una distancia v  t atraviesan la pared de la izquierda en un tiempo  t v vtvt A Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t +  t. c A v  t El número de moles presentes en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v  t. c El número de moles que atraviesa cada unidad de área por unidad de tiempo se llama Flujo, J. mol m -2 s -1

32 v vtvt A Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t +  t. c A v  t El número de moles presentes en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v  t. c El número de moles que atraviesa cada unidad de área por unidad de tiempo se llama Flujo, J. mol m -2 s -1 J = c movilidad fuerza

33 Para estudiar la selectividad de los canales compararemos los flujos de los iones medidos al aplicar la misma fuerza a todos. Los factores que gobiernan la selectividad son entonces la concentración y la movilidad.

34 J = concentración movilidad fuerza Movilidades relativas a la del K en el agua En un poro acuoso las diferencias de movilidades entre Na y K son pequeñas Examinemos entonces las concentraciones

35 Suponiendo que el flujo es pequeño, se puede usar el coeficiente de partición, , para expresar la concentración en el borde de la membrana en función de la concentración en el seno de la solución. C (membrana) C (solución) ¿Cuál es la concentración dentro de una membrana? J = c sol  movilidad fuerza

36 En el equilibrio ( J = 0 ) los potenciales químicos son iguales

37 Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119 Armstrong:Selectividad versión 1971

38 Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119 Armstrong:Selectividad versión 1971 La posición de mínima energía para el ion es equidistante de los grupos C=O. La energía de interacción es igual para todos los iones

39 Estados de referencia: 1 mol por litro de ion en fase gaseosa Solución 1 molal de iones en agua Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y gaseosa. Robinson and Stokes “Electrolyte Solutions” Butterworths,London 1959.

40 Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y una membrana que no interactúe con los iones. Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y gaseosa. J = c sol  movilidad fuerza Pregunta: ¿Cual será la selectividad de una membrana que interactúa por igual con todos los iones?

41 J = c sol  movilidad fuerza Pregunta: ¿Cual será la selectividad de una membrana que interactúa por igual con todos los iones? Muy bien: la selectividad será Cs > Rb > K > Na > Li Agreguemos ahora un efecto de tamiz: discriminación por tamaño.

42 Por la energía de hidratación: la selectividad es Cs > Rb > K > Na > Li ¿Cuál será el ion preferido si se excluye el Cs y el Rb por tamaño?. ¿Cuál será el ion preferido si se excluye el Cs, Rb y K por tamaño?. El potasio El sodio

43 Mecanismo de transporte ¿Se mueven en forma independiente los iones?

44 En equilibrio  G = 0 Ecuación de Nernst Termodinámica del transporte pasivo de iones

45 Razones de flujos unidireccionales de isótopos radiactivos 1  0 Ecuación de Ussing  

46 Razones de flujos unidireccionales de isótopos radiactivos R = 8.3 J mol -1 K -1 T = 293 K z = 1 F = 95600 C mol -1 1  0

47 Razones de flujos unidireccionales de isótopos radiactivos Resultados de para los flujos de potasio en axones gigantes de jibia Hodgkin y Keynes 1955 J.Physiol (London) 128:61-88 Conclusión la razón de flujo no cumple con lo esperado para el movimiento independiente de los iones en el canal.

48 Los iones se mueven dentro del canal en fila india Isótopo A del K Isótopo B del K           A0B4A0B4 A1B3A1B3 A2B2A2B2 A3B1A3B1 A4B0A4B0 Existe sólo un estado A 1 B 3 un estado A 2 B 2 y un solo estado A 3 B 1 12

49 La constante  es la probabilidad por unidad de tiempo que un ion del lado 1 de un choque efectivo con la entrada del canal. Tiene unidades de frecuencia, s -1 La constante  es la probabilidad por unidad de tiempo que un ion del lado 2 de un choque efectivo con la entrada del canal. Tiene unidades de frecuencia, s -1  12  12

50 Teoría de transporte en fila india Isótopo A del K Isótopo B del K Los estados de la figura son A 4 B 0 A 3 B 1 A 0 B 4 y A 1 B 3 Para una vía de paso con n sitios el único estado que da flujo de A desde el lado 1 al lado 2 es A n B 0 El único estado que da flujo de B desde el lado 2 al lado 1 es A 0 B n

51 Teoría de transporte en fila india A0B4A0B4 A1B3A1B3 A2B2A2B2 A3B1A3B1 A4B0A4B0 12 Para una vía de paso con n sitios el único estado que da flujo de A desde el lado 1 al lado 2 es A n B 0

52 Teoría de transporte en fila india A0B4 A1B3 A2B2 A3B1 A4B0 12 Para una vía de paso con n sitios el único estado que da flujo de B desde el lado 2 al lado 1 es AoBn

53 Teoría de transporte en fila india Isótopo A del K Isótopo B del K A n-1 B 1 A n B 0   En equilibrio

54 Teoría de transporte en fila india Isótopo A del K Isótopo B del K

55 Teoría de transporte en fila india Isótopo A del K Isótopo B del K

56 Teoría de transporte en fila india Isótopo A del K Isótopo B del K

57 Razones de flujos unidireccionales de isótopos radiactivos Resultados de para los flujos de potasio en axones gigantes de jibia Hodgkin y Keynes 1955 J.Physiol (London) 128:61-88 Conclusión hay flujo más de 1 ion en el canal. Experimental

58 Conclusiones 1955 El canal de potasio es un poro largo Los iones circulan en fila india Hay más de 1 ion en el canal. Salto en el tiempo a 1989

59 Potenciales de flujo Corrientes de flujo Un canal en que el agua y los iones se mueven en fila india Pongo igual concentración de potasio a ambos lados del canal Pongo igual potencial eléctrico a ambos lados del canal Que flujo neto de K se espera? Agrego un no electrolito a un lado del la membrana con el canal Que flujo neto de K se espera? Esta es la corriente de flujo. A que potencial el flujo se hace cero? Este es el potencial de flujo.

60 Corriente de K a través de un canal de potasio en presencia de un gradiente osmótico. Las concentraciones de K a ambos lados de la membrana son iguales por lo que el potencial de Nernst para el K es 0 mV.. El gradiente osmótico lleva el potencial de inversión de la corriente a 4 mV. El flujo de agua por los canales arrastra potasio. Hay entre 2 y 4 moléculas de agua en el canal. Su longitud es de 6 a 12 Ångström. Alcayaga et al 1989 Biophysical J. 55:367-371

61 Topología de los canales de Ca2, Na+ y K+ sugerida de sus perfiles de hidrofobicidad x4 x2

62 Los canales pueden formarse a partir de una sola molécula de proteína, pueden ser tetrámeros o dímeros

63 En los canales de K+ dependientes de potencial el segmento S4 y el poro (P) están muy conservados

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65 Doyle et al 1998 Science 280:69-77

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69 12Å 6 a 12 A Alcayaga et al 1989

70 Zhou et al 2001 Nature 414:43-48 Aumentando la resolución de la estructura.

71 Zhou et al 2001 Nature 414:43-48

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74 - + - + El ion + es atraído por la carga negativa. El ion + es atrapado por la carga negativa.

75 - ++ - ++ El ion + se acerca a un par con carga neta cero El ion + se aleja de un par con carga neta cero.

76 Morais-Cabral et al 2001 Nature 413:37-42 2-4 aguas/canal Alcayaga et al 1989

77 Intermedio