Degradación aeróbica de tolueno:

Presentación del tema: "Degradación aeróbica de tolueno:"— Transcripción de la presentación:

1 Degradación aeróbica de tolueno:
el plásmido TOL

2 Representative hydrocarbons in petroleum
Alkanes n-alkane Ramified alkane Ciclics Ciclopentane Ciclooctane Biciclooctan Ciclohexane Bicicloheptane Aromatics Benzene Naphtalene Fenantrene Benzo (a) pirene

3 Hidrocarburos aromático:
Representativos de contaminación (petróleo e industria) Estructuras muy estables Contaminantes antropogénicos Estructuras diseñadas para ser muy estables (Diseñadas para ser tóxicas) DIFÍCILES DE DEGRADAR

4 COMPUESTOS CONTAMINANTES DE ORIGEN INDUSTRIAL
Orgánicos Pesticidas (concentraciones traza pero MUY tóxicos) Compuestos aromáticos policíclicos Hidrocarburos policlorados, solventes orgánicos y carburantes (BTEX) Solventes orgánicos NO clorados Tintes, detergentes, ... Inorgánicos Fosfatos y nitratos (agricultura intensiva) Metales tóxicos (Zn, Cd, Ni, Cu, Pb, Cr, Hg, Mo, As, Se)

5 ORGANISMOS IMPLICADOS EN LA RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS
MICROORGANISMOS Bacterias Muy versátiles Buen nivel de conocimiento Fáciles de manipular Hongos Versátiles Bajo nivel de conocimiento de cepas silvestres Difíciles de manipular PLANTAS Gran tamaño (visibles) Manipulables INVERTEBRADOS Como reactores (futuro?)

6 Manipulación requiere CONOCIMIENTO PREVIO
• Organismos y sus posibilidades • Rutas disponibles • Regulación de la rutas • Mecanismos disponibles para su manipulación ¿Qué conocimiento tenemos? ¿Cómo llegamos esta información?

7 C H t o l u e n 3 Compuesto natural Origen antropogénico
constituyente del petróleo (BTX) Origen antropogénico t o l u e n Clasificado como contaminante prioritario por la EPA Ejemplo mejor estudiado Compuesto modelo Conocimiento profundo a nivel bioquímico, genético, fisiológico, manipulación de rutas, circuitos reguladores, evolución, etc...

8 Bioquímica de la degradación aeróbica de tolueno
CH3 tolueno Bioquímica de la degradación aeróbica de tolueno Plásmido TOL Pseudomonas putida mt-2 Aislada en los años 60 Microbiología 1900 1930 Microorganismos capaces de crecer a expensas de compuestos aromáticos "Ecología microbiana" 1960 1as evidencias de una nueva ruta: rotura en meta Bioquímica 1940 1950 Oxidación de la cadena lateral del tolueno Oxidación del benceno vía catecol Estudios exhaustivos de degradación de alquilaromáticos Aislamiento e identificación de intermediarios

9 Pseudomonas putida mt-2
Dos rutas diferentes para la degradación de benzoato: Rotura en orto (puede degradar BENZOATO) Rotura en meta (puede degradar METIL-BENZOATOS) C O H C O H CH3 Aparecen mutantes espontáneos que parecen cambiar su metabolismo de tipo meta a tipo orto. ben+, m-ben- Han perdido TODAS las enzimas de la ruta meta. Son MUY estables (no hay revertientes). Mismo fenotipo se obtiene curando con Mitomicina C El carácter el TRANSMISIBLE Los genes de la ruta meta presentes en un plásmido: TOL (pWW0)

10 Métodos para el estudio de rutas
• Detección e identificación de compuestos intermediarios (resting cells) • Estudios isotópicos • Estudios de adaptación simultánea • Obtención y análisis de mutantes

11 TOL TOD TOM TBU T4MO P. putida mt-2 P. putida F1 B. cepacia G4
R. pickettii PK01 T4MO P. mendocina KR1

12 Intermediarios centrales
X I D A C Ó N d e l a n i o R U P T G E L Í AEROBIOSIS CH3 O H C 2 Activación del anillo Apertura del anillo Oxidación Reacciones periféticas O H C p r o t c a e u g n i s Intermediarios centrales catecol

13 C A T E C O L H O C H C O O H C H C H C H N H N C O O H H C O C O O H
3 2 C H N H 2 N C O O H H a n t r a c e n o L - m a n d e l a t o t o l u e n o L - t r i p t ó f a n o f e n a n t r e n o C O C O O H C H O H C O C H C H N H 2 2 2 C O O H C O O H N H C H O O H f o r m i l q u i n u r e n i n a a l c o h o l n a f t a l e n o b e n z o i l f o r m i a t o C H O b e n c í l i c o s a l i c i l a t o C O C H C H N H C H C H C O O H b e n z a l d e h í d o 2 2 C O O H N H 2 C O O H C O O H q u i n u r e n i n a c i n a m a t o b e n c e n o N H 2 N H O H 2 b e n z o a t o a n t r a n i l a t o a n i l i n a f e n o l O H O H C A T E C O L

14 Cis-benzoato dihidrodiol
P. putida mt-2 Ruta TOL CH2OH Alcohol bencílico CHO benzaldehído COOH benzoato CH3 XO DH DH tolueno CH3 xyleno T1,2DO HOOC H OH Cis-benzoato dihidrodiol catecol DHDH Rotura en posición meta

15 cis-toluene dihydrodiol
X F C1 C2 B A T S I G E D H CH 3 toluene ISPTOL O2 FerredoxinTOL ReductaseTOL NAD+ (todC1C2) (todB) (todA) ISPTOL FerredoxinTOL ReductaseTOL NADH+H+ CH 3 H OH OH H cis-toluene dihydrodiol NAD+ (todD) NADH+H+ CH 3 OH OH 3-Methylcatechol O2 (todE) Ring fission

16 No todos los sustituyentes están permitidos
Orto Meta

17 Rotura del anillo: DIOXIGENASAS
OH OH C A T E O L meta orto 2,3 Dioxigenasa 1,2 Dioxigenasa C O H C O H cis,cis-muconato Semiladhido hidroximucónico

18 M E T A Catecol 2,3 Dioxiganasa O H O H O H O H C H O O O H O H C O O
- m e t i l c a t e c o l O 2 Catecol 2,3 Dioxiganasa O 2 O H O H C O O H C O O H C H O C H 3 O H C O O H C O s e m i a l d e h í d o 2 - h i d r o x i m u c ó n i c o C H 3 2 - h i d r o x i , 6 - o x o s e m i a l d e h i d o s e m i a l d e h i d o 2 , 4 - h e p t a d i e n o a t o 2 - h i d r o x i m u c o n a t o 2 - h i d r o x i m u c o n a t o d e s h i d r o g e n a s a 2 - h i d r o x i , 6 - o x o h i d r o l a s a O 2 , 4 - h e p t a d i e n o a t o h i d r o l a s a C O O H O H 2 - o x o 4 - p e n t e n o a t o C O O H C O 2 C O O H 2 - h i d r o x i - 2 , 4 - p e n t a d i e n o a t o h i d r a t a s a 4 - o x a l c r o t o n a t o ( e n o l ) H O O 4 - o x a l c r o t o n a t o i s o m e r a s a C O O H 4 - o x a l c r o t o n a t o 4 - h i d r o x i - 2 - o x o v a l e r a t o d e s c a r b o x i l a s a O 4 - h i d r o x i - 2 - o x o v a l e r a t o a l d o l a s a C O O H + C O O H C H C H O C H C O C O O H 3 3 4 - o x a l c r o t o n a t o ( c e t o ) a c e t a l d e h í d o p i r u v a t o a c e t a l d e h í d o d e s h i d r o g e n a s a O C H C S C o A 3 a c e t i l C o A

19 O R T O O H H O O C O H O H O H O c a t e c o l 1 , 2 - d i o x i g e
p r o t o c a t e c u a t o O c a t e c o l 1 , 2 - d i o x i g e n a s a p r o t o c a t e c u a t o O 2 2 3 , 4 - d i o x i g e n a s a H O O C C O O H C O O H C O O H C O O H c i s , c i s - m u c o n a t o b - c a r b o x i - c i s , c i s - m u c o n a t o m u c o n a t o l a c t o n a s a b - c a r b o x i m u c o n a t l a c t o n a s a H O O C C O O H C O O H O O O O m u c o n o l a c t o n a g - c a r b o x i m u c o n o l a c t o n a C O O H O m u c o n o l a c t o n a g - c a r b o x i m u n l t d e s i s o m e r a s a O b - c e t o a d i p a t o e n o l l a c t o n a b - c e t o a d i p a t o e n o l l a c t o n a h i d r o l a s a O C O O H C O O H b - c e t o a d i p a t o b - c e t o a d i p a t o s u c c i n i l C o A t r a n s f e r a s a O C O S C o A C O O H b - c e t o a d i p i l C o A b - c e t o a d i p i l C o A t i o l a s a O O C S C o A H O O C H C C S C o A 3 s u c c i n i l C o A a c e t i l C o A

20 OXIGENASAS Dioxigenasas CH3 Monoxigenasas CH3  del anillo
 Tolueno dioxigenasa  Benzoato dioxigenasa  (Metil)benzoato dioxigenasa (“toluate dioxygenase”)  abren el anillo CH3  Catecol 1,2-dioxigenasa  Catecol 2,3-dioxigenasa  Protocatecuato 3,4-dioxigenasa Monoxigenasas  del anillo  Tolueno 2-monooxigenasa  Tolueno 3-monooxigenasa  Fenol hidroxilasa  Tolueno 4-monooxigenasa CH3  4-hidroxibenzoato 3-hidroxilasa  de la cadena lateral  Xileno monooxigenasa

21 Flavoproteína reductasa sulfoférrica
Dioxigenasas del anillo Flavoproteína reductasa sulfoférrica C H 3 NAD+ FAD o FMN Flavoproteína reductasa [2Fe-2S] Ferredoxina Rieske [2Fe-2S] Fe++ Oxigenasa Compuesto aromático O H+ NADH+H+ C H 3 H O O C H O H H O H O H H Derivado dihidroxilado

22 Transporte de electrones
Dioxigenasas del anillo Clase Transporte de electrones Oxigenasa Ejemplo 4-sulfobenzoato FMN 3,4-dioxigenasa [2Fe-2S] 4-clorofenilacetato IA FMN 3,4-dioxigenasa [2Fe-2S] FMN ftalato 4,5-dioxigenasa [2Fe-2S] FAD 2-oxo-1,2-dihidroquinolina 8-monoxigenasa [2Fe-2S] IB FAD benzoato 1,2-dioxigenasa [2Fe-2S] dibenzofurano IIA FAD 4,4a-dioxigenasa benceno IIB FAD 1,2 dioxigenasa R III FAD naftaleno 1,2 dioxigenasa [2Fe-2S] R Reductasa Ferredoxina ISP ISP [2Fe-2S (mononuclear]

23 A resaltar: Es una limitación, pero  es manipulable.
Generalmente varias subunidades Cadena más o menos compleja de transporte de electrones. La reacción que llevan a cabo es similar. Especificidad de sustrato Sustratos metabolizados por la ruta TOL: tolueno, m-xyleno, p-xyleno, 3-etiltolueno, 1,2,4 trimetilbenzeno, ... Es una limitación, pero  es manipulable. “Rasgos” que identifican una ruta: Modo de activación del anillo Modo de rotura del anillo

24 Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (abFe3+)12 P. putida
Ohlendorf et al., 1988

25 Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (abFe3+)12 P. putida
Orville et al., 1997

26 Catecol 2,3-dioxigenasa (aFe++)4 P. putida mt-2
Kita et al., 1999

27 Catecol 1,2-dioxigenasa (aFe3+)2 Acinetobacter sp. ADP1
4-metilcatecol Vetting & Ohlendorf, 1999

28 Degradación anaeróbica de tolueno

29 Introducción Catabolismo de hidrocarburos aromáticos se consideraba EXTRICTAMENTE dependiente de O2. En las rutas descritas, el ataque inicial del anillo requiere SIEMPRE O2 molecular (Mono- y Dioxigenasas). Últimos 10 años: algunos organismos TAMBIÉN puede degradar Hidrocarburos en ANAEROBIOSIS. Procesos anaerobios están empezando a mostrar un gran POTENCIAL para la solución de problemas de contaminación ambiental.

30 Historia Observación: aromáticos NO se acumulan en la naturaleza en zonas anaerobias. El tolueno es degradado en sedimentos contaminados con hidrocarburos. 1990 Se consiguen los primeros cultivos puros. Tanto de zonas contaminadas como pristinas Están taxonómicamente relacionados

31 Aerobio vs anaerobio Aerobios: Oxígeno cumple dos funciones:
- Aceptor de electrones (RESPIRACIÓN) - Sustrato de las dioxigenasas Anaerobios: - Oxígeno puede sustituirse por OTROS ACEPTORES - La reactividad del O2 en Oxigenasas es INSUSTITUIBLE Estos organismos deben de haber desarrollado rutas diferentes, novedosas, independientes del oxígeno.

32 reducción de diferentes aceptores de electrones.
Reacciones estequiométricas de oxidación anaeróbica de tolueno acopladas a la reducción de diferentes aceptores de electrones. Bacterias desnitrificantes : C7H NO H HCO N H2O Gº’ = kJ (mol tolueno)-1 Bacterias reductoras de hierro (III) : C7H Fe(OH) FeCO Fe3O H2O Gº’ = kJ (mol tolueno)-1 • Bacterias sulfatoreductoras : C7H SO4= + 3 H2O HCO H HS- Gº’ = -205 kJ (mol tolueno)-1

33 Cepas bacterianas disponibles en cultivo puro e identificadas
Bacterias desnitrificantes (subclase  de proteobacterias) Thauera aromatica K172 Thauera aromatica T1 Azoarcus sp. Cepa T. Azoarcus tolulyticus Tol4 Azoarcus tolulyticus Td15 Bacterias reductoras de hierro (subclase  de proteobacterias) Geobacter metallireducens GS15 Bacterias sulfatoreductoras (subclase  de proteobacterias) Desulfobacula toluolica Tol2 Desulfobacterium cetonicum

34 Elucidación de la ruta La activación del sustrato (tolueno) y la rotura en ausencia de O2 es similar en todas las cepas anerobias, independientemente del aceptor de electrones que utilice. ¿Cómo se activa el anillo? ¿Cómo es la apertura del anillo? Microbiología/ecología de anaerobios.

35 Métodos Estudios isotópicos (compuestos marcados con 13C o 14C).
Detección e identificación de intermediarios Inhibodores metabólicos Análogos del tolueno Bajas temperaturas Limitación en aceptores de electrones Adaptación simultánea Análisis de mutantes En muchos cultivos, se observa acumulación transitoria de BENZOATO y/o BENZOIL-CoA C O H S C o A O CONFIRMACIÓN: aparece benzoil-CoA en Estudios in vitro con extractos crudos libres de células. Estudios in vivo con sustratos marcados

36 Se identifica BENCIL-SUCCINATO
H b e n c i l s u a t o Este compuesto se había considerado inicialmente un producto terminal no metabolizable (dead-end) Se propone el primer paso de la reacción: ADICIÓN DE FUMARATO C H 3 t o l u e n O b c i s a f m r Estudios cinéticos in vivo/in vitro apoyan la propuesta Se identifica la bencilsuccinato sintetasa

37 Thauera aromatica K172 C H S o A O B : g No requiere ATP
3 S o A O b e n z i l t u 2 [ ] c s a f m r E - x h d p B : g No requiere ATP Se detecta E-fenilitaconilCoA Velocidad aumenta en presencia de succinilCoA como fuente de CoA Se detecta actividad SuccinilCoA:bencilsuccinato CoA-transferasa

38 Anillo activado (benzoilCoA)
No se han detectado ni todos los intermediarios ni todas las reacciones. Pero cada vez hay más datos que apoyan esta ruta. Comprobado en detalle en Thauera y Azoarcus (desnitrificantes) Algunas de las reacciones se han identificados en bacterias sulforreductoras (muy distintas filogenéticamente). Mecanismo común a todas las cepas (?) Anillo activado (benzoilCoA) Rotura: en todos los casos, reacción hidrolítica. Es necesaria una reducción previa del anillo: BenzoilCoA Reductasa (requiere ATP; es MUY específica) Sigue -oxidación Las reacciones hasta la rotura del anillo están DEMOSTRADAS en Thauera y en Rhodopseudomonas

39 C O H S o A 6 - h i d r o x i 1 - c i c l o h e x e n o B e n z o i l
3 2 [ ] 1 , 5 - c i l h e x a d n r b 6 t p m 6 - h i d r o x i 1 - c i c l o h e x e n o B e n z o i l C o A r e d u c t a s a C o A h i d r a t a s a 1 - c a r b o x i l C o A d e s h i d r o g e n a s a O S C o A O S C o A O S C o A O S C o A C 2 A T P 2 [ A D P + P ] C H O C C i 2 N A D + N A D H + H + O b e n z o i l C o A 2 [ H ] 6 - c e t o 1 - c i c l o h e x e n o C O H S o A Rhodopseudomonas palustris PimelilCoA 2 H O 2 1 - c a r b o x i l C o A h i d r o l a s a C O H S o A 2 a c e t i l C o A 3 - h i d r o x i p i m e l i l C o A d e s h i d r o g e n a s a O S C o A O S C o A O S C o A C C O S C o A C O C O O H C O O H C O O H

40 Muy sensible a O2 (V = 20 s) Bencilsuccinato sintetasa a2b2g2 aa’b2g2
Activador (¿ORF?)

41 Especificida de sustrato
BenzoilCoA reductasa Especificida de sustrato 2[4Fe-4S] Ferredoxina Fe/S FAD Benzoil CoA reductasa Donador de electrones? abgd

42 C o - s u s t r a t o s a n a e r o b i o s : 2 [ H ] , C O , A T P ,
m e d i o s S C o A O H c e n t r a l e s ( a n a e r o b i o s ) b e n z o i l - C o A O 2 [ H ] 2 A N A E R O B I O S I S 2 A T P O H O S C o A O H r e s o r c i n o l R E D U C C I Ó N d e l a n i l l o R U P T U R A H I D R O L Í T I C A O H C o A S H C O H H O O H f l u o r o g l u c i n o l O H I n t e r m e d i o s O O H c e n t r a l e s 2 c a t e c o l ( a e r o b i o s ) O H O X I D A C I Ó N d e l a n i l l o C O O H R U P T U R A O X I G E N O L Í T I C A O H O O H A E R O B I O S I S 2 O H p r o t o c a t e c u a t o C O O H C O O H C O O H H O C o - s u s t r a t o s a e r o b i o s : O , H O O H 2 2 g e n t i s a t o

43 O H C N 2 A T E L 3 a n i l t r c e o s f b z d h í - m u p ó q

44 B E N Z O I L C o A C O O H C H C O O H C O O H C H O H C H N H C H C
3 2 C H N H 2 C H C H C O O H O C H O H 3 C H 2 O H O H O H O H O C H H N C H C O O H 3 2 v a i n i l l a t o p - c r e s o l p r o t o c a t e c u a t o f e n o l a l c o h o l N C H 2 O H p - m e t o x i b e n c í l i c o H c u m a r a t o t r i p t ó f a n o C O O H f e n i l a l a n i n a N H C O O H 2 N H 2 C O O H C H O H H N C H C O O H 2 a n i l i n a 2 C H 2 2 - a m i n o b e n z o a t o C O O H C l O H 3 - c l o r o b e n z o a t o a l c o h o l C O p - h i d r o x i b e n z o a t o b e n c í l i c o O S C o A C O H t i r o s i n a f e n i l - o x o a c e t a t o O S C o A O S C o A C C C O H b e n z o a t N H N H 2 2 t o l u e n C H 3 o - a m i n o b e n z o i l C o A O H p - h i d r o x i b e n z o i l C o A O S C o A C B E N Z O I L C o A

45 Características generales de cepas anaerobias que degradan tolueno
Tanto estrictas como facultativas. Espectro de hidrocarburos aromáticos que son capaces de degradar es MUY REDUCIDO. tg generalmente mayor que en aerobios. (desnitrificantes son las que tienen velocidad de crecimiento mayor) Muchas formas de respiración.

46 Identificación de GENES
Mutagénesis al azar - química - transposones  SELECCIÓN de clones inactivos secuenciación (cromosoma) Genoteca - Complementación - Búsqueda de actividades Confirmación - producto génico - Comparación con proteína conocida Análisis de secuencia

47 Aplicaciones Gran potencial para la solución de problemas de contaminación medioambiental. Zonas contaminadas con frecuencia son ANAEROBIAS. OXIGENACIÓN  $$ TRANSPORTE  no es considerable en áreas grandes. Considerar recuperación in situ basada en organismos ANAEROBIOS. Adición de otros aceptores de electrones, más solubles (fácil y barato). Degradación lenta Aplicable cuando la contaminación sólo afecta al suelo (no hay acuífero amenazado).

48 Estimaciones energéticas potenciales
Oxígeno disuelto en agua saturada: 8,6 mg/l Esto permitiría oxidar 2,8 mg tolueno/l Concentración saturante de sulfato en agua: 2 g/l Esto permitiría oxidar (anaeróbicamente) 300 mg tolueno/l Pero Procesos aerobios son mucho más RÁPIDOS. Organismos aerobios son más versátiles.

49 Acuíferos aeróbico Accidente! O2 contaminante O2 NR MnR contaminante
Zona no saturada Accidente! O2 contaminante O2 NR MnR contaminante contaminante NR MnR O2 Tiempo FeR SR

50 SO4= NO3- contaminante M O2 NR SR FeR S= N2 Zona no saturada H2O CO2
CH4 Fe(III) Fe(II) S= H2O N2 Zona no saturada