Genética Historia del ADN

Presentación del tema: "Genética Historia del ADN"— Transcripción de la presentación:

1 Genética Historia del ADN
Universidad Nacional del Santa Facultad de Ciencias Departamento de Biología, Microbiología y Biotecnología Genética Historia del ADN Blga. Pesq. Eliana Zelada Mázmela Blgo. Acuic. Carmen Izásiga Barrera

2 La Genética como ciencia
Bateson (1905) “engendrar” transmisión de caracteres hereditarios Ciencia de potencialidades información se transfiere de padres a hijos Ciencia que responde a cuatro interrogantes: - ¿dónde se encuentra y cómo se organiza? - ¿cómo se transmite y recombina? - ¿cómo se expresa? - ¿cómo cambia y cómo afecta ese cambio en la evolución Transferencia y reacciones del genotipo Objetivo: Definido por Bateson: “la investigación de los fenómenos de la herencia y variación” Estudiar las causas semejanzas Entre los tipos de desarrollo de diferentes organismos diferencias

3 Aspectos Históricos: Origen de la Vida
a) Teoría creacionista. b) Teoría de la generación espontánea (abiogénesis). c) Teoría de Oparín-Haldane. d) Teoría de la panspermia Teoría creacionista: Los primeros seres vivos se explican como producto del impulso creativo de una fuerza sobrenatural (Dios) cuyo estudio por definición, no puede abordarse en términos científicos. Teoría de la generación espontánea (abiogénesis). Idea vitalista, que duró 2000 años, dominó el pensamiento hasta el siglo XVII. Propone que la aparición de seres vivos es a partir de algo no vivo. apoyada por Aristóteles. Decían que para producir materia viva a partir de materia inorgánica, se almacenaban camisas sudadas y trigo en un lugar oscuro para producir ratones. En 1668, Francesco Redi: experiencia con carne descompuesta. En 1862, Pasteur descubrió que las bacterias, levaduras y protozoarios eran la causa de la descomposición de la materia orgánica.

4 Experiencia de Redi

5 c)Teoría de Oparín-Haldane
c)Teoría de Oparín-Haldane. Oparín, propuso en 1924 que la atmósfera primitiva debió contener cantidades importantes de metano, amoníaco, hidrógeno, vapor de agua y carecer de oxígeno libre De acuerdo con Haldane, la tierra tenía una atmósfera formada por bióxido de carbono, amoníaco y agua pero carente de oxígeno libre; al interaccionar la radiación ultravioleta de origen solar, se formó una gran cantidad de compuestos orgánicos, como azúcares y AA, que al acumularse en los mares primitivos, formaron la llamada “sopa primigenia”, donde surgieron los primeros organismos. c) Teoría de la panspermia. Propone que la vida es eterna y se halla presente en cualquier rincón del universo. Según Svante August Arrhenius en 1906 dice que la vida se desarrolló a partir de una espora o una bacteria que llegó del espacio exterior y que se desprendió de un planeta en el que hubiese vida.

6

7 Teoría de la Preformación
1868: Darwin “todo lo referente a la herencia es maravilloso” La vida sólo engendra vida no a la generación espontánea Los animales generan animales Teoría de la Preformación - En 1694: Hartsoecker homúnculo - Swammerdan decía: En la naturaleza no hay generación, sino solamente el desarrollo de partes. Así se explica el pecado original, todos los hombres estaban contenidos en los órganos de Adán y Eva. Cuando su depósito de óvulos se agote, la raza humana dejará de existir. A comienzos del siglo XVIII, esta doctrina gozaba de gran aceptación: la controversia era si los embriones en miniatura preformados estaban en los óvulos o en los espermatozoos. Lo absurdo era el inmenso número de huevos o semillas con que habían de estar dotados los animales primitivos. En 1772 se hizo el cálculo de que, incluso tomando como base la edad atribuida al mundo en la Biblia, de alrededor de seis mil años, el número de conejos contenidos por el primer conejo debía estar alrededor de los cien mil. Ni siquiera esta consideración bastó para disuadir a muchos biólogos prominentes de aquel tiempo.

8 2) Epigénesis El avance de los microscopios homúnculo fruto de la imaginación. Wolff y K.E. Von Baer gametos eran gotas de líquidos. El desarrollo es algo más que un simple crecimiento el cuerpo en desarrollo pasa por una serie de transformaciones radicales donde se forman órganos inexistentes anteriormente. Wolff vitalista: órganos se forman por una fuerza vital misteriosa Von Baer corrigió esta exageración 1º en ver un embrión de perro lº en dar la información detallada del desarrollo embrionario del pollo. Decía que desde el momento de la fecundación, el cuerpo ya tenía una estructura compleja, con el desarrollo experimentaba cambios Hoy se sabe que la familia de genes HOX codifican para un grupo de factores de transcripción, responsables de regular la morfogénesis y de conferir la identidad axial para el desarrollo del embrión.

9 3) Hipótesis Provisional de la Pangénesis
Darwin (XIX) trató de visualizar la herencia a través de una especulación: Cada célula produce una copia “gemmula”, la sangre las lleva a los espermatozoides donde se juntan gameto: compuesto por partículas representativas del cuerpo sangre Por negro Por blanco Invalidada por Galton: transfusiones

10 4) Herencia de los caracteres adquiridos
Existen dos series de hechos: a) Primero: Que los organismos son modificados por el ambiente b) Segundo: Que la descendencia se parece a los progenitores Si se relacionan estas dos series de hechos las modificaciones inducidas en los padres por el ambiente, se transmitirán a la descendencia que la hereda” Lamarck: HCA es el mecanismo más importante en la evolución

11 5) Teoría del Plasma Germinal Propuesta por A. Weismann en 1842
Hizo experiencias en ratones Consideró a tejidos reproductores: germoplasma Supuso separado y diferente Otros tejidos del cuerpo: somatoplasma

12 Demostró que sucede lo contrario con la pangénesis: el plasma germinal se perpetúa a sí mismo e incidentalmente engendra el soma. Epitomizado por Butler: “la gallina es el medio del cual se vale el huevo para producir otro huevo” Los genes del cuerpo se reproducen a sí mismos, el resto es un subproducto de su autorreproducción

13

14 X En la Biología Moderna: Plasma germinal: genotipo Somatoplasma: fenotipo

15 Herencia Biológica y Legal
En el lenguaje preformístico: Herencia pero Casa pasa de un propietario a otro sin que ella cambie en el proceso La herencia del color de los caracteres es diferente: los únicos objetos materiales que se heredan son los genes contenidos en los gametos. La HB se realiza mediante un proceso dinámico de desarrollo orgánico Cigoto embrión feto niño adulto El color de los ojos no pasa de P a H, sino que se origina epigenéticamente durante el desarrollo

16 Logros de la Genética Gregor Mendel: Padre de la Genética
Hugo de Vries, Carl Correns, Erick von Tschermarck Bateson: Genética, promovió el concepto mendeliano de genes apareados Lucien Cuenot: genes controlan el pelaje Garrod. Un gene, una enzima Johansen. Palabra “gene” , introdujo genotipo y fenotipo Roux: cromosomas son portadores de factores hereditarios Boveri y Sutton: experimentos que probaron lo anterior: “teoría del gene” desarrollada por Morgan Griffith: principio transformante Avery y colab.: ADN material genético Watson y Crick: Modelo estructural del ADN Ochoa: Código Genético

17 Naturaleza Química del Material Hereditario

18 Información Posicional
En la caracterización del material hereditario hay dos interrogantes: ¿Cómo se reproduce fielmente generación tras generación? ¿Cómo se transfiere la información a partir del material genético, para especificar la síntesis de CHON? Si bien preguntas basadas en términos de la estructura molecular Las respuestas no están solamente en las propiedades físicas de la molécula, sino que es importante su UBICACIÓN Información Posicional Material genético

19 La Lógica Química de la Vida
Todas las propiedades de los organismos vivos resultan de las propiedades de las proteínas que contienen. Las propiedades que posee una proteína dada, resulta de la secuencia de sus aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de una proteína, está determinada por la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos constituyen el material hereditario que cada organismo pasa a la siguiente generación y es el mismo en todos los organismos.

20 Historia del ADN Puede dividirse en 3 períodos: 1869 – 1943 :
Cuando Weismann emitió teoría plasma germinal Promulgó que se transmitía intacto a la siguiente generación Debía tener una composición química y estructura molecular definida sino No sólo Miescher: 1875 nucleína en núcleo células de pus y de esperma de salmón Se demostró que esta sustancia constaba de ADN y CHON Cuatro nucleótidos

21 F. Miescher

22 Morgan: identificó genes en cromosomas: Teoría cromosómica
el núcleo y más concretamente los cromosomas son la sede físico química de la herencia Wilson asoció a Weismann y Miescher: la nucleína es el material genético de la cromatina: No creíble por inestabilidad del ADN Analítico trabajo de Phoebus Levene (1920) hizo pensar que el ADN era un polímero repetitivo de 4 nucleótidos en secuencia fijada: ATCGATCGATCGATCGATCGATCG... TACGTACGTACGTACGTACGTACG... 44 = 256 ¿Cómo podría ser entonces expresada la complejidad de los genes usando una capacidad de información tan limitada? Cifra más grande que el Nº total de partículas fundamentales 1080 CHON = 50 – 500AA X = 300 AA

23 2) 1944 – 1960: Hasta 1930: ácido timonucleico: animales.
ARN : ácido zimonucleico: vegetales Griffith (1914): Existencia de una sustancia transformante 2) 1944 – 1960: Avery: ADN es la sustancia genética y se aceptó que el ADN era algo más que la simple repetición de un tetranucleótido Feulgen: descubrió una técnica para teñir ADN Bouvin & Vendrely, Mirsky & Ríos: en 1948 demostraron que la concentración de ADN era igual en todas las células de un individuo y en todos los individuos de la misma sp. Hershey & Chase: Se inyecta ADN y no CHON ADN dirige su propia replicación y la síntesis de las CHON. Watson & Crick: estructura secundaria del ADN. R, T, T.

24 ADN cumple con dos funciones:
Eritrocito Hepatocito Espermatozoide Sábalo , , ,91 Carpa , , ,64 Trucha , ,67 Rana , , Sapo , ,70 Cantidad de ADN (ugx10-6) La Teoría cromosómica descendió a nivel molecular: ADN componente más característico de los cromosomas, constituye el soporte molecular de los factores hereditarios ADN cumple con dos funciones: Transportar: ADN ARN CHON Dirigir su propia replicación

25 Dogma Central de la Biología Molecular

26

27

28 Fue sorpresivo encontrar ADN en el pneumococco, aunque ya había sido reconocido como material genético de los eucariotes Proporcionaron una idea unificadora de la base de la herencia entre eucariotas y procariotas “ Si estamos en lo cierto, significa que los AN son importantes no sólo a nivel estructural, sino que son sustancias fundamentalmente activas en la determinación de las actividades bioquímicas y de las características específicas de la célula. Por medio de ella es posible inducir de manera predecible cambios heredables en las células.” Avery dijo

29 3) 1960 a adelante : Evidencias Directas Indirectas
Conceptos afirmados ADN se modifica, analiza y sintetiza Se vislumbra su dinamismo metabólico Se transporta de un organismo a otro Es transcrito en reverso Ejerce función en mitocondrias y cloroplastos Evidencias Directas Indirectas . Fenómeno de la transformación Asociación entre TC y Feulgen . Exp. Bacteriófago marcado Relación entre cantidad de ADN y dosis génica . Exp. Virus mosaico tabaco ADN metabólicamente estable . Relación entre espectro de absorción de ADN y actividad mutagénica de los UV

30 Experiencia de Griffith Hay un principio transformante

31

32

33 Experiencia de Avery . Cápsula proteica . ADN . ARN
. Cubierta polisacárida . Cápsula proteica . ADN . ARN

34 Experiencia del bacteriófago marcado: Hershey & Chase (1952)

35 Alfred Hershey y Martha Chase

36

37

38 Experiencia de Fraenkel-Conrat y Singer (1957)

39 Requisitos que debe de cumplir una molécula hereditaria
Las moléculas hereditarias deben poseer una estructura tal que permita los siguientes hechos: Contener información biológica útil y que se transmita en forma estable. Que su replicación permita el paso sin variación de la información de célula a célula y de generación en generación. Que sea capaz de expresarse en la forma biológicamente más ahorrativa en la síntesis de CHON. Es decir, que la traducción de su mensaje debe de hacerse por mecanismos sencillos. Deben de ser capaces de variación ocasional, lo que obedece a la necesidad biológica de la evolución, con la producción de nuevos genotipos, sobre los cuales pueda actuar la selección natural. Es decir debe permitir la mutación y la recombinación.

40 Los Acidos Nucleicos Son moléculas formadas por la unión de un azúcar, una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. Los Ácidos Nucléicos (DNA y RNA) son formados por varias cadenas de nucleótidos (polinucleótidos). Glucosídic

41 Bases Nitrogenadas 3 6 7 8 9 5 1 4

42 O NH2 CH3

43 O NH2 pirimidina imidazol

44 Azúcar 1’ 2’ 3’ 4’ 5’

45 Radical Fosfato

46

47 Base nitrogenada Azúcar Nucleósido Nucleósido Radical fosfato
Nucleótido Nucleótido Nucleótido Nucleótido Nucleótido ... = AN

48 Adenina, guanina, citosina, timina Radical fosfato ADN
Desoxirribosa Adenina, guanina, citosina, timina Radical fosfato ADN Ribosa Adenina, guanina, citosina, uracilo Radical fosfato ARN En el ARNt ya se confirma la existencia de ribotimilato En el DNA fagos hay uracilo

49

50 Terminología empleada para referirse a los nucleósidos y nucleótidos.
Base Nitrogenada Nucleósido Nucleótido Adenina Adenosina Ácido Adenílico Guanina Guanidina Ácido Guanílico Citosina Citidina Ácido Citidílico Timina Timidina Ácido Timidílico Uracilo Uridina Ácido Uridílico Terminología empleada para referirse a los nucleósidos y nucleótidos.

51 Propiedades de las bases nitrogenadas
Tautomería: Reacciones intramoleculares que determinan un equilibrio entre isómeros con diferencias en sus enlaces. Los tautómeros preferentes determinan el apareamiento de bases que se observa en el DNA. Son dos las formas: lactama y lactima. Bajo las condiciones de pH y temperatura el equilibrio está casi totalmente desplazado a lactama, amino, amida interna o forma ceto, en lugar de lactima, imino, imida interna o forma enol.

52 b) Rotación en torno al enlace glucosídico
En nucleótidos las dos conformaciones se interconvierten. La rotación en torno al enlace glucosídico (entre la pentosa y la base) determina dos corformaciones: Sin: la base sobre la pentosa. Lo puede tener G Anti: La base hacia fuera. Ambos se interconvierten en nucleótidos de purina. La forma anti predomina en nucleótidos de pirimidina y en los ácidos nucleicos.

53 c) Absorción de luz: Sirve para cuantificar ácidos nucleicos espectrofotométricamente

54 Estructura del ADN: Primaria
En un monucleótido, el grupo fosfato es un éster fosfórico primario, lo que quiere decir que posee un solo enlace éster. En el dinucleótido se forma el enlace fosfodiéster, es decir el fosfato está unido a dos grupos.

55

56 La información codificada radica en la secuencia de las BN
El dinucleótido formado es 3’ – 5’ fosfodiéster. Se pueden seguir añadiendo más nucleótidos, estableciéndose un esqueleto: azúcar – fosfato – azúcar, con una base unida a cada azúcar en su posición 1’. La información codificada radica en la secuencia de las BN secuencia esqueleto

57 pApA ApAp 3 5 OH P El grupo ortofosfato puede esterificarse en 5’– 3’ o en 3’ – 5’

58 ¿Por qué desoxirribosa y no ribosa?
El grupo fosfato es vulnerable a la ruptura química o enzimática ¿Por qué desoxirribosa y no ribosa? La presencia de un grupo OH en posición 2’ de la ribosa, hace que el polinucelótido sea menos estable: el OH se encuentra adecuadamente situado para atacar el P en presencia de iones OH - , causando la rotura de la unión fosfodiéster y formar un enlace cíclico 2’, 3’

59 Fosfonucleótido 5’ Fosfonucleótido 3’

60

61 Estructura Secundaria
Modelo propuesto por Watson y Crick en 1953. Son dos hebras antiparalelas, en forma de hélice, que se mantienen unidas por el apareamiento complementario de las bases: A –T y C- G Presencia de grupos cetónicos y amínicos: lo que ofrece la oportunidad para formar enlaces H Cetónico: T, U Amínico: A Amínico – Cetónico: C, G Espectro de difracción de rayos X: Wilkins y Atsbury Forman un puente Forman dos puentes

62 M.Wilkins y R.E.Franklin (Londres)
L.Pauling (Caltech) M.Wilkins y R.E.Franklin (Londres) J.D.Watson y F.H.C.Crick (Cambridge)

63 James Watson y Francis Crick

64 Para determinar la estructura tridimensional o disposición espacial de las moléculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se recoge la difracción de los rayos sobre una película fotográfica. La película se impresiona en aquellos puntos donde inciden los rayos X, produciendo al revelarse, manchas. El ángulo de difracción presentado por cada una de las manchas en la película suministra información sobre la posición en la molécula de ADN de cada átomo o grupo de átomos. Mediante esta técnica de difracción de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados: Las bases púricas y pirimidínicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje del polinucleótido a una distancia de 3,4 Las bases son estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury, 1947). El diámetro del polinucleótido es de 20 A y está enrollado helicoidalmente alrededor de su eje. Cada 34 A se produce una vuelta completa de la hélice. Existe más de una cadena polinucleotídica enrollada helicoidalmente (Wilkins et al. 1953, Frankling y Gosling, 1953).

65

66

67 Regla de la Equivalencia
El modelo secundario descrito requiere cantidades equivalentes de A y T y de C y G. Demostrado por Chargaff por cromatografía antes que Watson y Crick propusieran el modelo: A/T y C/G = 1 A/G y C/T = 1 En contraste con la universalidad de la complementariedad, la proporción A + T/ G+C varía enormemente de una especie a otra:

68 A – T C – G T – A G - C 4/2 = /4 = 0,5 4/4 = /2 = 1 G – C C - G 1/1 = /5 = 1 1/5 = 0, /1 = 5 83,3 % 33,3 % Con el mismo significado se usa la proporción G+C/total de bases o %G-C, característico de cada especie.

69 Procedencia del ADN A G C T 5-Me-C 28,2 21,5 21,2 27,8 1,3 28,7 22,2
Timo de Bovino 28,2 21,5 21,2 27,8 1,3 Esperma de bovino 28,7 22,2 20,7 27,3 Germen de trigo 22,7 16,8 27,1 6,0 Saccharomyces 31,3 18,7 17,1 32,9 - Escherichia coli 26,0 24,9 25,2 23,9 Mycobacterium tuberculosis 15,1 34,9 35,4 14,6 ØX174 24,3 24,5 18,2 32,3 T3 23,7 26,2 27,7 23,5 T5 30,3 19,5 30,8 T7 32,4 18,3 17,0 HMC Virus ARN U Mosaico del tabaco (TMV) 29,8 25,4 18,5 26,3 Mosaico amarillo nabo 22,6 17,2 38,0 Poliomielitis 28,6 24,0 22,0

70 Organismo Tejido A+T/G+C Escherichia coli - 1,00 Diplococcus pneumoniae 1,59 Mycobacterium tuberculosis 0,42 Levadura 1,79 Paracentrolus lividus (erizo mar) Esperma 1,85 Arenque 1,23 Rata Médula ósea 1,33 Hombre Timo 1,52 Hígado 1,53

71 Orientación de las hebras
5 ’ 3’ Una hebra se orienta en sentido 5’ – 3’ y la otra en sentido 3’ – 5’, es decir son antiparalelas Diapositiva 69 3’ 5 ’

72

73

74

75 Resumen de las características del modelo
Las dos hebras son helicoidales La doble hélice tiene un diámetro de 20 A La doble hélice da un giro completo cada 34 A hacia la derecha: dextrógira La distancia entre dos nucleótidos sucesivos es de 3,4 A, es decir en una vuelta hay 10 nucleótidos. Las dos hebras son antiparalelas Las dos hebras giran en hélice, una alrededor de la otra, enlazándose mediante puentes H en la parte central Hay un apilamiento de bases que estabilizan la estructura helicoidal, que puede ser mucho más fuerte que la que establece los puentes H entre las dos cadenas.

76

77 Consecuencias de la doble hélice
Estructura de doble hélice: estabilidad Inexistencia de restricciones respecto a la secuencia de bases de su estructura primaria: útil como molécula informativa Un gen = 1000 pb promedio número inimaginable de combinaciones Estructura doble: replicación exacta Complementariedad: replicación, transcripción y traducción. Los cambios ocasionales de unas bases por otras: mutaciones Intercambio de segmentos entre cromátidas hermanas: recombinación

78 nº de nucleotidos por vuelta
TIPO DE ADN GIRO DE HELICE nm por Vuelta Plano entre bases nº de nucleotidos por vuelta A Dextrógiro 2.8 inclinado 11 B 3.4 perpendicular 10 Z Levógiro 4.5 zig-zag 12 Tipos de ADN

79 ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11 pares de bases por giro completo y 23 A de diámetro. Es interesante por presentar una estructura parecida a la de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN. ADN-B: ADN en disolución, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja fuerza iónica, se corresponde con el modelo de la Doble Hélice.  ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3 pares de bases por giro completo y 19 A de diámetro. ADN-Z: doble hélice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro completo, 18 A de diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC), sigue un curso en zig-zag por el cambio syn a anti. Requiere una concentración de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las CHON que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos básicos sería posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z. La célula lo puede hacer metilando la C.

80 Modelo A

81 Las purinas están en posición sin
Modelo Z

82 El 'ADN zurdo' sirve para 'editar' el mensaje de los genes
El 'ADN zurdo' sirve para 'editar' el mensaje de los genes. Fuente: The New York Times. Cuando en 1979 los científicos vieron de verdad por primera vez la molécula de la vida, el ADN, no se trataba de la espiral curvilínea que Francis Crick y James D. Watson habían descubierto más de 25 años antes. Sus observaciones correspondían a una molécula que se curvaba hacia la derecha. Sin embargo, lo que reveló la cristalización de la molécula en 1979 fue una extraña y zigzagueante molécula espiral que giraba hacia la izquierda. Se denominó ADN zurdo, o ADN-Z, y los biólogos lo tacharon de casualidad, probablemente nada más que basura molecular. Pero Alexander Rich, biólogo molecular del Instituto Tecnológico de Massachusetts (EE UU) que fue el primero en ver el ADN zurdo, nunca lo abandonó. Ahora Rich y sus colegas han demostrado que el ADN-Z es más que una rareza. En la investigación descrita recientemente en la revista Science, descubrieron que la naturaleza elabora y utiliza un ADN zurdo, y puede que su papel a la hora de regular la química de la vida sea bastante importante.

83 Inicialmente se creía que el ADN era simplemente pasivo, un código que leer. Pero ahora, con éste y otros ejemplos que se están estudiando, parece que el ADN es activo, y puede cambiar su propio mensaje escrito según se va leyendo. La forma del ADN, tanto si es diestro como zurdo, ayuda a determinar la forma en que se lee este mensaje. Cuando aparece la versión zurda, salta la molécula editora , se adhiere al ADN-Z, y altera el mensaje que se está leyendo. Como consecuencia, resulta que existe más de una forma de leer el mensaje del ADN, la forma normal y la forma editada . Las proteínas producidas por células con ADN editado resultan importantes en la vida. Según Rich, una de ellas se utiliza como una de las principales moléculas receptoras del cerebro. Sin ella, los animales tienden a desarrollar epilepsia y muchas veces mueren. Otra molécula editada es un receptor de serotonina. La versión editada de la molécula proporciona una respuesta más tamizada a la serotonina y, por tanto, permite unas reacciones mezcladas, más afinadas, en vez de sólo las reacciones que se producen con la versión sin editar.

84

85 ADN triple hélice o ADN-H: In vitro es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. Este oligonucleótido se une a pares de bases A-T y G-C mediante enlaces de hidrógeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del oligonucleótido y los pares A-T y G-C de la doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.

86 ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucarióticos (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem  una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P  TTGGGTTGGGGTTGGGG TTGGGG  3'OH

87 Palíndromos: Es una figura gramatical que se lee igual en los dos sentidos, por ejemplo: DABALE ARROZ A LA ZORRA EL ABAD. En el palíndromo de doble cadena la secuencia de bases se lee igual en dirección 5’ P→ 3’OH en ambas cadenas.

88 T A G C T A G C Región palindrómica en un DNA de doble hebra
TTAGCACGTGCTAA Lectura 5´→ 3´ T A G C 5’ 3’ eje binario de simetría (rotacional) T A G C 5’ 3’

89 Estructura Terciaria Se refiere a como se almacena el ADN en un volumen reducido. Varía según se trate de organismos procariotes o eucariotes: En procariontes se pliega como una super-hélice en forma, generalmente, circular y asociada a una pequeña cantidad de proteínas, no histonas. Lo mismo ocurre en las mitocondrias y en los plastos. En los eucariotas está unido a proteínas del tipo histonas, constituyendo la cromatina

90 Propiedades del ADN Tamaño y peso molecular: Se utilizan unidades moleculares: nanómetros y amstrong Para el PM se utiliza el dalton: 1 d = masa de 1 átomo de H = 1,66 x 10 –24 g 1 vuelta 34 A pb X X = 2491 pb = = 2 x 106d Así, si se determina el PM se puede calcular indirectamente la longitud y su contenido genético Genoma más pequeño: 1,7 u SV40 ( 5 a 10 genes) Hombre: 1,6 a 8,2 cm: 48 a 240 megabases

91 2. Propiedades Físicas y Químicas
a) Absorbancia: Mide la concentración del ADN en función de la cantidad de luz de una determinada longitud de onda que es absorbida por las moléculas en la solución. La molécula duplexa presenta menor absorbancia. Se puede calcular la pureza de la solución con la proporción 260/280. La absorbancia de un mol de ADN es de un 35 a 40% al valor calculado de la absorbancia de las bases que la componen: efecto hipocrómico

92 Bases nitrogenadas Proteínas Absorción máxima 260 nm Absorción máxima 280 nm DNA A260 A280 = 1,8 RNA 2,0

93 b) Interacciones Iónicas: Debido a la presencia del gran número de fosfatos hacia su superficie, el ADN se comporta como un fuerte polianión: polianión, que le permite reaccionar con moléculas positivas c) Viscosidad: Es directamente proporcional a la resistencia de sus componentes a flotar: - ADN duplexo: fuertemente viscoso

94 d) Sedimentación en centrifugación: Se usa para separar ácidos nucleicos. Hay dos técnicas:
En gradiente de densidad preformada: La posición del ADN en el tubo depende del tiempo de exposición y del tamaño de la molécula

95

96

97

98 En cloruro de cesio: Cuando la concentración de ClCs es la misma en todo el tubo, las moléculas de ADN se separan en la base de su propia densidad relativa, que no depende sólo de su tamaño sino de su conformación. Cuando la concentración es diferente lo hace en base a su tamaño Importante para obtener riqueza en pares GC. El ADN duplexo con mayor GC se va más al fondo que el que tiene más AT en igualdad de tamaño

99

100 e) Desnaturalización – desnaturalización: Marmur y Dotty demostraron que incrementando lentamente la Tº, el ADN pierde su naturaleza duplexa. También demostraron que existe un Tm. La dinámica de la desnaturación se midió a través de la absorbancia: efecto hipercrómico

101 Tm de desnaturalización

102 Relación entre el Tm y la cantidad de pares GC

103

104 Cuando el ADN se enfría vuelve a recuperar su estructura duplexa, si se lee a 260 nm baja la absorbancia: efecto hipocrómico La velocidad de renaturalización del ADN de un organismo está relacionada con su complejidad. La complejidad se define como la suma del número de nucleótidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el número de veces que está repetida. El ADN de los virus y las bacterias en su mayoría sólo tiene secuencias que están una sola vez en el genoma (secuencias únicas). Sin embargo, los organismo más complejos, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen secuencias únicas (SU), secuencias de bajo número de copias (SBNC, 2-10 copias), secuencias repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106 copias).

105 Curvas Cot de renaturación

106 Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios puntos de inflexión. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (únicas, moderadamente repetidas, y altamente repetidas). Se usa el cot ½

107 f) Energía libre: ( G) Su relación señala el grado de estabilidad de la doble hebra. Es una constante termodinámica que indica la cantidad de energía consumida (+) o liberada (-) en una reacción. Se mide Kcal/mol Globalmente cuando se va a formar una estructura de bases emparejadas, se libera energía y su estabilidad está en esa capacidad para liberarla. Se libera energía en cada par de bases que se forman g) Hibridación: Las técnicas de desnaturalización y posterior renaturalización se utilizan para conseguir la hibridación de ácidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble hélice, es posible volver a formar una doble hélice con una hebra de ADN que sea complementaria (hibridación de ADN con ADN) o volver a formar una doble hélice con un segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridación de ADN con ARN).

108 Se puede identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARNm
Se puede identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARNm. Si se aísla un mensajero determinado en una célula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la célula previamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restricción.  Las endonucleasas de restricción de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrómico y cortan por el interior de la secuencia diana a la misma altura en las dos hélices de ADN (corte simétrico) o a distinto nivel en cada hélice (corte asimétrico). 

109 METODOS DE ESTUDIO ELECTROFORESIS Separación de moléculas de DNA y RNA de distinto tamaño por migración en un campo eléctrico. Objetivos: Elaborar cariotipos moleculares. Conocer la ubicación de genes en cromosomas. Elaborar mapas físicos y genéticos. Elaborar mapas de restricción. Caracterizar, amplificar y secuenciar moléculas de DNA. Elaborar perfiles de DNA que permitan identificar a individuos,diferenciar poblaciones, razas o especies. Perfiles de DNA de utilidad en el diagnóstico de enfermedades genéticas e infecciosas. Terapia con drogas y/o terapia genética.

110 Preparación gel agarosa Instalación equipo electroforesis
Muestra DNA Preparación gel agarosa Instalación equipo electroforesis Colocación muestra DNA Migración DNA Longitud de fragmentos de DNA Coloración de bandas DNA Fotografía EtBr

111 Bienvenidos al mundo del ADN
¡ Good luck!