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Transferencia de masa En un proceso de bioreacción, los sustratos son consumidos y los productos son formados por acción de un microorganismo, ó partes.

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1 Transferencia de masa En un proceso de bioreacción, los sustratos son consumidos y los productos son formados por acción de un microorganismo, ó partes catalíticas de un organismo, por ejemplo enzimas. Los sustratos típicos para una célula viviente son la fuente de carbono como son los azúcares y el aceite, fuentes de nitrógeno como amoníaco y aa, aceptores de electrones como el O 2. Los productos pueden ser toda clase de compuestos orgánicos, biomasa y CO 2. Para una velocidad óptima de reacción, el microorganismo, el investigador académico ó el proceso industrial de ingeniería deben ser tal que la transferencia de sustratos a la enzima ó superficie celular (ó el sitio de reacción dentro de la célula), y la remoción de P hacia afuera de la enzima u organismo sea lo más rápida posible, y preferiblemente que no haya etapas limitantes en la velocidad de la reacción. Esta transferencia involucra una serie de etapas. La etapa más lenta es la que determinará la velocidad de transferencia de masa total, y su valor debe ser comparado con la etapa de reacción cinética más lenta, para ver si la transferencia de masa afectará el comportamiento del proceso total o no. Enfocaremos reacciones que involucran células enteras. En biotransformaciones enzimáticas, las células están ausentes y el Nº de etapas de transferencia de masa disminuído, pero se pueden aplicar los mismos conceptos.

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3 Cadena de etapas de transferencia de masa para un sustrato ó nutriente desde una burbuja de gas, gotas de líquido, ó partículas sólidas hacia el sitio de reacción dentro de la célula. Etapas en la transferencia de masa 1- Transferencia (principalmente por difusión) de sustratos desde la fase gaseosa, fase líquida ó sólida a la interfase líquida acuosa. 2- Transporte (por una combinación de difusión y convección) a través de una película delgada de fase acuosa que rodea a la burbuja de gas, gotas de líquido, ó partículas sólidas. 3- Transporte (por convección ó turbulencia) a través de la fase líquida a una capa delgada que rodea al microorganismo ó a partículas (aglomerados, pellet, carrier de inmovilización) que contiene a un grupo de organismos. 4- Transporte (difusivo) a través de esta capa a la superficie celular. 5- Transporte (pasivo por difusión y / o activo con transporte de enzimas), por fuera de la membrana celular a un sitio dentro de la célula donde la reacción tiene lugar. Los productos formados hacen el camino inverso.

4 Fermentadores con y sin agitación mecánica: modos de contacto gas - líquido

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6 Reactores mecánicamente agitados

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8 Efectos de las limitaciones de la transferencia Si una etapa de transferencia de masa es más lenta que la etapa de reacción cinética clave, esto limitará la formación de un P deseado a partir de un dado sustrato. Como resultado, se pueden observar dos efectos tanto con células libremente suspendidas ó con organismos inmovilizados dentro de agregados de células ó partículas sólidas. La velocidad de reacción total es menor que la máxima teórica, y el output del proceso es menor que el deseado. Ej: en la formación de ácido glucónico a partir de glucosa por una bacteria aeróbica gluconobacter oxidans. La velocidad total de la reacción está determinada por la velocidad a la cual el oxígeno es transferido a la fase líquida. Otro Ej es el suministro limitado de azúcar a células inmovilizadas debido a la poca difusión dentro de un carrier de inmovilización. La velocidad total de producción es a menudo reducida reversiblemente. Hay Ej de sistemas donde la capacidad biosintética de una célula se daña irreversiblemente después de exponerse a una limitación de transferencia de oxígeno (fermentación de penicilina). La selectividad de la reacción es alterada. Por Ej el oxígeno sirve como un aceptor de electrones en la formación de las levaduras de panadería a partir de glucosa.

9 En ausencia de oxígeno los electrones se dirigen al piruvato resultando la formación de etanol y CO 2, en vez de producir más levaduras. Otro Ej son los cultivos de Bacillus subtilis para la producción de acetoína y 2,3 butanodiol. La relación de estos dos productos depende de la [O 2 ] disuelto, y de la relación entre velocidades de transferencia y consumo de O 2. De nuevo el daño puede ser reversible ó irreversible. Transferencia entre fases La transferencia de oxígeno a partir de una burbuja de aire al microorganismo en un bioproceso aeróbico es una etapa de transporte relativamente lenta. El oxígeno y otros gases solubles que se dispersan en soluciones acuosas ( como hidrocarbonos hasta 4 átomos de carbono), pueden depleted caer rápidamente cuando son consumidos. Si no se los reemplaza a la misma velocidad alta la situación será nefasta para el microorganismo. La transferencia de material líquido - líquido ó líquido – sólido es comparable con la transferencia de masa gas líquido. Un Ej. Es el crecimiento sobre hidrocarbonos superiores (> 6 átomos de C). La fase aceitosa está presente en la forma de pequeñas gotas y la resistencia a la transferencia de masa está a un lado de la capa acuosa limitante. También el intercambio de material entre una fase sólida (partículas de sustrato, partículas que contienen microorganismos) y la fase líquida obedece a principios similares.

10 Transferencia dentro de una única fase Dentro de una burbuja de gas ó gotas de aceite hay el movimiento suficiente para garantizar una transferencia rápida de moléculas a la interfase con la fase acuosa, tal que la resistencia está del lado acuoso de la interfase. Si la distancia en toda la fase líquida es muy larga, puede ocurrir una resistencia de transporte. Esta situación se da en biorreactores largos donde el líquido se mezcla de una forma sub óptima. En la industria es importante tener en cuenta esta limitación sobre el sistema de reacción microbiana. Las limitaciones de transferencia de masa dentro de una fase sólida puede ocurrir con partículas de biocatalizadores que contiene microorganismos inmovilizados, ya sea como un bio film superficial unido a un carrier, ó dispersadas a través del material del carrier. El microorganismo usualmente filamentoso puede estar como aglomerado ó pellet. Un sustrato que entra a la partícula ó pellet puede consumirse tan rápido que nada entra al interior de la partícula, por lo tanto la eficiencia del catalizador es casi máxima. Además la reacción puede declinar debido a un producto inhibitorio ó tóxico, por lo tanto no se puede mover lo suficientemente rápido.

11 Transferencia a través de la membrana celular El microorganismo por si mismo puede considerarse como una fase separada (sólida ó líquida). El transporte a través de la envoltura celular (pared y membrana) ouede ser limitado, dependiendo del tamaño y propiedades físicas (hidrofobicidad, carga eléctrica) de la molécula y si el organismo está equipado con un mecanismo de transporte específico ó no. Se distinguen tres mecanismos: Difusión libre: transporte pasivo regido por una gradiente de concentración. Difusión facilitada: usa una proteína carrier. Transporte activo: el transporte se hace también con una proteína carrier con el aporte de energía libre.

12 El diámetro de las células microbianas es muy pequeño (1 a 5 micras) tal que la difusión dentro de la célula es más rápida que el transporte a través de la envoltura celular. Además en células eucariotas hay orgánulos intracelulares (vacuolas, mitocondrias) que pueden representar otra barrera al transporte. Sin embargo en términos cuantitativos este tipo de transporte es mucho más rápido que la velocidad de consumo dentro de la célula, y normalmente no limita la velocidad total en la cadena de etapas del transporte. Ecuaciones de transferencia de masa La ecuación de Fick establece que la transferencia de masa, J, de un componente en una sola fase será proporcional al gradiente de concentración en la dirección del transporte. J = -D dC / dx Cuando se considera la transferencia de masa en una fase sólida, D es la difusividad efectiva, una función del coeficiente de difusión, la porosidad del sólido y la forma de los canales dentro del sólido. Para la geometría de una hoja plana de una capa limitante con espesor d en un fluído estacionario, la relación entre el flujo de masa y la diferencia de concentración, sería: J= D C / d D / d es el coeficiente de transferencia de masa, y la inversa d / D se interpreta como la resistencia contra el transporte.

13 C es la fuerza impulsora para la transferencia. Para una situación de estado no estacionario, la solución de un balance de masa para una de diámetro dx resulta: D δ 2 C / δ x 2 = δ C / δ t D: coeficiente de difusión ó difusividad efectiva (m 2 / seg) C: concentración en la fase líquida (mol / m 3 ) x: distancia (m) t: tiempo (seg) Estas ecuaciones se pueden usar para calcular la transferencia de masa para un proceso por difusión. Como pre requisito se pide que el transporte convectivo esté ausente, pero esto es muy raro. Lo usual es encontrar una combinación de difusión y convección con la fase de transferencia. Como problema adicional tenemos que el patrón de velocidad del flujo líquido no es conocido. Así para una transferencia de masa gas – líquido y líquido – partícula en reactores reales se prefiere una aproximación más empírica. Transferencia de masa entre fases líquido – gas ó líquido sólida Se aplica la teoría de las dos películas que dice que el flujo de masa en ambas fases debe describirse en forma separada, mientras que la transferencia total se determina por dos pasos en serie a través de la película, según la figura siguiente:

14 El flujo de masa de la transferencia gas – líquido está descripto por: J g =k g (p- p ¡ ) Transporte en la película gaseosa J l = k l (C i - C) Transporte en la película líquida J g : flujo de masa molar a través de la película gaseosa (mol / m 2 seg) k g : coeficiente de transferencia de masa en la película líquida (m / seg) p: presión (bar Nt / m 2 ) p i :presión del lado de la interfase gaseosa J l : flujo de masa molar a través de la pélícula líquida (mol / m 2 seg) k l : coeficiente de transferencia de masa de la pélícula líquida (m / seg) C i :concentración de la interfase del lado líquido (mol / m 3 ) C: concentración en la fase líquida Las concentraciones a ambos lados de la interfase p i y C i no son idénticas, pero ambas están relacionadas por el coeficiente de Henry, H: p ¡ =HC ¡ En la práctica no es posible medir los valores interfaciales, por lo tanto se trabaja con un flujo de masa como una función de las concentraciones en ambas fases: ]=K (C * - C)

15 H: coeficiente de Henry (bar m 3 / mol) K: coeficiente de transferencia de masa total (m / seg) C *: concentración de saturación en el equilibrio en la fase líquida (mol / m 3 ) C: concentración en la fase líquida (mol / m 3 ) Donde: C * = p / H es el valor de saturación en la fase líquida. (C * - C): fuerza impulsora total K: coeficiente de transferencia de masa total que resulta de la suma de las resistencias de la transferencia. 1/ K = 1 / (H k g ) + 1/ k l Esta ecuación general puede simplificarse como: 1 / (H k g ) «1 / k ¡ ( la resistencia de la película de la fase gaseosa es despreciable comparada a la resistencia de la película líquida). Usualmente la transferencia de masa se expresa por unidad de volumen del reactor, más que por unidad de área interfacial por que no es fácil de determinar. La velocidad de transferencia de masa volumétrica se expresa por: ] a = k l a (C* - C)(2) a: área interfacial gas – líquido por unidad de volumen (1 / m) ó área por unidad gas – sólido más el volumen de líquido ó área por unidad gross del volumen del tanque.

16 K l a: coeficiente volumétrico de transferencia de masa (1 / seg). Cuando consideramos la transferencia de oxígeno del gas al líquido, el producto Ja se llama OTR, ó velocidad de transferencia de oxígeno. Para estimar un valor de K l a seguro se deben hacer suposiciones sobre C* (ó p) y C. Para un reactor en escala laboratorio:(< 10 l de volumen operativo) La fase líquida se supone que está bien mezclada por lo tanto C es cte en todo el líquido. Sin embargo en planta piloto ó en una escala > (> 100 l) no sucede lo mismo, hay variaciones de concentración que se deben tener en cuenta. Suposiciones para la fase gaseosa: 1.p = p in constante, hay poca ó no existe depletion de la entrada de gas. Es verdadero para reactores pequeños con un flujo de gas alto y relativamente poca transferencia. p in :presión del gas a la entrada (bar) 2.p = p out constante, la fase gaseosa está perfectamente mezclada. Se aplica a sistemas pequeños, pero la velocidad de transferencia es alta comparado al flujo de la fase gaseosa.

17 p out : presión del gas a la salida (bar) 3.p varía dentro del reactor, para reactores pequeños la p se expresa por su valor promedio logarítmico. En reactores grandes con un mezclado adecuado la presión hidrostática determina p, y en tanques grandes con mezclado pobre se deben usar modelos complejos. El valor de H y C* son una función de la composición del líquido y la temperatura (los gases son en general menos solubles a T altas). La ley de Henry implica que C* depende linealmente con la p.

18 Transferencia de masa gas – líquido en sistemas reales Como es experimentalmente difícil determinar los valores de kl y a por separado, se usa kla como un solo parámetro. Diferenciamos los dos tipos dominantes de reactores que se pueden usar: Columna de burbujas – air lift reactors y reactores tanque agitados. En cada caso las propiedades del líquido influyen en la magnitud de la transferencia de masa. Ej: Un líquido con gran coalescencia de burbujas. La transferencia de masa es lo más pobre. Un líquido sin coalescencia da la mayor velocidad de transferencia de masa. Columna de burbujas: el gas entra por unos orificios del distribuidor. Si el caldo es coalescente y no viscoso, las burbujas tomarán rápidamente su diámetro promedio de equilibrio de 6 mm.

19 Cuando la velocidad del flujo de aire es lo suficientemente alta el tanque es operado en un flujo de régimen heterogéneo y el hold – up es una función de la velocidad superficial del gas (flujo de gas por unidad de área de la sección transversal del tanque), corregida por diferencias de presión (p 0 es la presión de referencia de 1 bar): ε = 0.6 (v g p o / p) 0.7 (1) V g : velocidad superficial de gas (m / seg) p 0 : presión de referencia (bar) p: presión (bar) Se ha verificado experimentalmente para el coeficiente de transferencia de masa, la siguiente relación: k l a = 0.32 (V g p O / p) 0.7 En líquidos no coalescentes, ej: soluciones iónicas y algunos caldos de fermentación, las burbujas que se originan por el distribuidor suben pero no se mezclan con otras burbujas, por lo que el tamaño es cuando las burbujas más grandes estén presentes. Si las burbujas son más grandes ellas se dispersan y toman el mismo valor de equilibrio como en líquidos coalescentes. En este tipo de reactores con un volumen > 50 m 3 las burbujas se expanden lo suficiente como para subir a través del reactor debido a la disminución de la presión hidrostática. Esto influye en la transferencia de masa.

20 Reactor air – lift : la distribución de burbujas resulta en un flujo del líquido hacia arriba, en la sección de arriba las burbujas escapan del líquido, y una sección de abajo donde el líquido es recirculado downward. Aunque se parece a una columna de burbujas, el hold – up del gas es es < que lo que predice la ec (1) debido a la interacción con el flujo del líquido. Por consiguiente k l a será menor respecto a la columna de burbujas. Reactor tanque agitado : el flujo está determinado por el balance: entre fuerzas de aireación y agitación. El gas distribuido se recoge rápidamente en las cavidades del gas, próximas a las paletas que giran del agitador. El flujo en éstas cavidades es de una turbulencia muy alta, y el gas es dispersado como pequeñas burbujas. Esto sigue en el flujo del líquido, pero también sube a la superficie. Ellas coalescen en áreas que son relativamente calmas y se redispersan en lugares donde la fuerza de corte es alta. Una parte de las burbujas es recirculada dentro de las cavidades y el resto escapa a la superficie. Hay una correlación disponible para el hold – up gas en líquidos coalescentes: ε = 0.13 (P g / V l ) 0.33 (v g p o / p) 0.67 ε:hold up P g : potencia cuando pasa aire V l : volumen de líquido (m 3 ) Para líquidos no coalescentes el valor del hold – up es considerablemente >. Las correlaciones de k l a son todas empíricas, P s / V l entre 0.5 y 10 kW m 3.

21 Líquidos coalescentes: k l a = (P g / V l ) 0.4 (v g p o / p) 0.5 Líquidos no coalescentes: k l a = (P g / V l ) 0.7 (v g p o / p) 0.2 En líquidos coalescentes la influencia de la aireación es más grande que la agitación, mientras que para líquidos no coalescentes ocurre lo opuesto. (Las correlaciones son independientes del tipo del agitador). La cantidad de potencia entregada por el agitador de diámetro D con una velocidad de rotación N (1 / seg)se expresa como: P=P O ρ l N 3 D 5 P: potencia de entrada (W) P 0 : Nº de potencia del agitador ρ l : densidad de la fase líquida (kg / m 3 ) El Nº de potencia es una función de la velocidad de aireación. El Nº de Reynolds (ρ l N D 2 /μ ) y el tipo de agitador según la figura:

22 Cuando un caldo es aireado, P 0 generalmente cae debido al tamaño en crecimiento de las cavidades dentro de las paletas del agitador. Algunos Nº de potencia de agitadores no aireados son una función del Nº de Re. En flujo turbulento (Re > 4000) en ausencia de aireación el valor de Nº de potencia para un agitador tipo turbina de 6 hojas es constante e igual a 5. En régimen laminar (Re < 1000) hay una proporcionalidad inversa con el Re, Ej para el agitador Rushton (P 0 64 / Re) Cuando se usan concentraciones altas de organismos filamentosos, los filamentos ramificados del micelio interactúan entre ellos y forman agregados que disminuyen el flujo libre del líquido. Esto resulta en una viscosidad alta y un comportamiento pseudoplástico ó elástico. Observaciones similares se han hecho cuando un microorganismo excreta sustancias poliméricas, como el xantano. La disminución de la transferencia de masa se debe en parte a la estimulación de la coalescencia de las burbujas, para formar burbujas grandes en el caldo. El Hold up es menor, por lo tanto el área interfacial será pequeña. En reactores grandes bajo condiciones extremas, se pueden observar burbujas de 1 m de diámetro. Algunas veces este efecto se compensa parcialmente por la presencia simultánea de un gran Nº de pequeñas burbujas (diámetro < 1 mm)

23 que tienen un tiempo de residencia largo en el caldo (15 min ó más). Hay también un efecto de viscosidad sobre k l. Esto se debe a la disminución de la velocidad del líquido, y no a una consecuencia directa de la viscosidad por si misma. En caldos aireados la potencia de entrada puede disminuir por el tamaño de las cavidades a medida que las paletas del agitador sean más grandes. Esto disminuirá las velocidades de corte y la ruptura de las burbujas. Para tanques agitados y medios no coalescentes: k l a = (P s / V l ) 0.7 (v g p 0 / p) 0.2 (μ / μ 0 ) – 0.7 Puesto que μ = μ 0 donde μ 0 = 0.05 Pa s. P s : potencia de entrada del agitador (W) μ : viscosidad dinámica (kg / m seg) μ 0 : viscosidad dinámica de referencia (kg / m seg) Si el caldo tiene un comportamiento pseudoplástico (la viscosidad disminuye con la velocidad de corte alta) ó fluído dilatante ( la viscosidad aumenta con velocidades de corte altas), se puede tomar una viscosidad promedio en el reactor: μ = K γ n - 1 γ : velocidad de corte promedio (1 / seg)

24 Que se puede estimar como: γ = 10 N K: índice de consistencia n: índice de ley de potencia Los parámetros K y en el modelo reológico dependen de la concentración de la biomasa. Típicamente K es proporcional a C α x con el valor de α entre 1.5 y 4. Para caldos pseudoplásticos n 1, y para medios Newtonianos n = 1. Transferencia de masa líquido - sólido La descripción de la transferencia de masa a través de una película líquida ó desde la superficie de un sólido es mucho más simple que para la transferencia gas – líquido. k l es dependiente de las propiedades sólido – líquido, y el valor del área interfacial puede ser determinado experimentalmente. Usualmente la transferencia sólido – líquido se aplica a situaciones donde la transferencia de masa y la reacción están interactuando: un sustrato es transportado a través de la película líquida a la superficie de una partícula donde los microorganismos están presentes para consumir el sustrato. Los productos formados son transportados a través de la película al volumen total del líquido. Estas situaciones se tratan a menudo en términos de cinética aparente, Ej: la velocidad de reacción observada se describe con expresiones cinéticas standard, se introduce un factor de efectividad (entre 0 y 1) para describir el comportamiento de la reacción comparado a la misma reacción sin limitaciones de transporte.

25 Transferencia de masa dentro de una partícula sólida Cuando hay microorganismos activos dentro de una partícula ó agregado celular, el transporte (por difusión) dentro de las partículas puede presentar otra resistencia. Esta situación se encuentra en procesos biocatalíticos con células inmovilizadas en alginato ó partículas sólidas porosas. Una descripción apropiada del fenómeno es difícil debido a que la cinética de las reacciones microbianas dentro de la partícula pueden diferir grandemente de aquellas con células suspendidas libremente, y por lo tanto desconocido. Esto es debido a condiciones fisiológicas alteradas para las células. Además de un factor de efectividad para la transferencia de masa externa, aparece un factor de efectividad total que incluye también la resistencia intrapartícula. Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa Para estimar el valor de k l a en los bioreactores se diseñan una serie de experimentos. Se usan modelos fluídos, tales como agua ó soluciones salinas, si es necesario con pulpa de papel ó polímeros agregados para imitar un caldo viscoso, y ver que se puede esperar en sistemas reales. Hay diversos métodos:

26 Método de la reacción química : Trata de imitar una reacción microbiana, el componente transferido puede ser consumido ó producido en una reacción química. Para estudios de transferencia de oxígeno, se puede usar el sulfito, que se oxida rápidamente a sulfato en la presencia de oxígeno y un catalizador. K l a se determina según midiendo la velocidad de consumo del sulfito. J a = k l a (C* - C)(2) J: flujo de masa molar (mol / m 2 seg) a: área interfacial por unidad de volumen de líquido (1/m) El producto J a = dC sulfito / dt, y C* = p / H para el oxígeno. Para obtener resultados seguros, se debe imponer la condición de que C es 0. Como alternativa para el sulfito se puede usar glucosa en combinación con la glucosa oxidasa (el oxígeno es consumido), ó una mezcla de agua oxigenada y catalasa ( el oxígeno es producido). También se pueden usar soluciones de Na(OH) para estudiar la transferencia de dióxido de carbono (el dióxido de carbono reacciona rápidamente con OH -.

27 Método del reemplazo físico : Consideramos un gas que es distribuido en estado estacionario, tal que C* es igual a C. El experimento comienza cuando la fracción molar de oxígeno en la fase gaseosa se cambia rápidamente del estado estacionario a otro valor. Por Ej. El nitrógeno gaseoso dispersado en un líquido es reemplazado por aire. El término J a es igual a dC /dt y por medidas continuas de la [O 2 ] en el líquido, se puede evaluar k l a de la ecuación (2). Otra posibilidad es un cambio súbito en la presión del componente a ser transferido. Este método es muy rápido, por lo tanto se requiere de un electrodo de oxígeno para medir la respuesta. Si se requiere un valor real de k l a, se deben aplicar teorías, modelos de sistemas y correlaciones pre establecidas. Para determinar k l a en cultivos en crecimiento, se usan los siguientes métodos: Método de la bioreacción en estado estacionario : cuando usamos un sistema microbiano que consume oxígeno, el k l a se calcula también a partir de la ecuación (2): J a = k l a (C* - C) J a, C* y C deben ser conocidos, y la diferencia (C* - C) lo suficientemente grande. Ej: para el oxígeno, J a (OTR) será igual a la diferencia de las fracciones molares de oxígeno a la entrada y a la salida, multiplicadas por las velocidades de gas a la entrada y la salida.

28 Velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) = velocidad de consumo de oxígeno (OUR). C*, teniendo en cuenta la presión parcial de oxígeno (C* = p / H), y C puede leerse usando un electrodo de oxígeno disuelto. Método dinámico: Cuando el flujo de aire es temporariamente reducido (se corta), ó bien es reemplazado por nitrógeno en un cultivo que respira. k l a para el oxígeno se vuelve cero, y la concentración de oxígeno disuelto cae rápidamente. La velocidad de disminución, dC / dt representa a la velocidad de consumo de oxígeno (q). Cuando se restablece la velocidad de flujo de oxígeno, la concentración retornará a su valor inicial. Con la ecuación (2) J a = k l a (C* - C) se determina k l a, ahora el término J a es igual a dC / dt + q. Este método es aplicable sólo para fermentadores pequeños (< 100 l), porque para fermentadores grandes la composición de la fase gaseosa no será uniforme después de dispersar con nitrógeno (el hold up del gas debe built up aún cuando se corta el flujo de gas). En cualquier caso se necesita un electrodo de oxígeno.

29 El oxígeno como sustrato El crecimiento en un cultivo microbiano con un sustrato limitante se expresa como: S μ = μ máx K S + S Con el oxígeno como sustrato S = C, que es la concentración de oxígeno. Cuando la velocidad de crecimiento en la fase de equilibrio se relaciona con la velocidad específica de absorción de oxígeno, se establece la ecuación siguiente: C L Q O2 = Q m K O2 + C L K 02 : cte de Michaelis Menten para el oxígeno Q O2 : velocidad específica de toma de oxígeno / peso seco celular (mM oxígeno / gr hr) Q m : velocidad específica máxima de toma de oxígeno Cuando el valor Q m se relaciona con la biomasa / l, se obtiene la velocidad de absorción de gas y de toma de oxígeno que se debe conseguir durante la fermentación. x Q m = k L a (c* - c L )(mM oxígeno / l hr) x: concentración de células (peso seco gr / l)

30 La velocidad de absorción de gas no es constante durante la fermentación ya que si un sustrato diferente del oxígeno se hace limitante, como sucede al final de la fase logarítmica, el valor puede ser reducido. Durante la fermentación de los organismos unicelulares y los productores de micelio existe una diferencia característica en la velocidad de absorción de oxígeno. Durante el crecimiento logarítmico, la velocidad de absorción de oxígeno aumenta y el contenido en oxígeno en el caldo desciende hasta que se hace limitante. Después con bacterias unicelulares la velocidad de absorción de oxígeno es constante hasta que otro sustrato se haga limitante. Sin embargo en fermentaciones miceliales (estreptomicetos y hongos), la velocidad de absorción desciende cuando el oxígeno se hace limitante, debido al aumento en el volumen del micelio y al aumento en la viscosidad relativa. Concentración crítica de oxígeno La concentración crítica de oxígeno es el término utilizado para indicar el valor de la velocidad específica de absorción de oxígeno que permite la respiración sin impedimentos.

31 A velocidades de absorción de oxígeno que son más bajas que las concentraciones críticas, la velocidad de respiración se correlaciona con la concentración de oxígeno en la solución. Por encima de este valor no se observa dependencia entre la velocidad de respiración y el oxígeno disuelto. En fluídos Newtonianos, como los que existen en las fermentaciones de organismos filamentosos (Ej: durante la producción de novobiocina con Streptomyces niveus), la concentración crítica de oxígeno depende de las condiciones de la fermentación. Concentraciones críticas de oxígeno de algunos organismos OrganismoC crít (mg/l) E. Coli0.26 Penicillium chrysogenum0.40 Sacharomyces cerevisiae0.60 Pseudomonas ovalis1.10 Torulopsis utilis2.00

32 Velocidad de consumo de oxígeno y concentración de oxígeno disuelto, en condiciones de limitación de oxígeno Cultivo bacterianoFermentación fúngica velocidad de absorción de oxígeno C L concentración de oxígeno disuelto

33 El efecto de la escala sobre la transferencia de masa Scale up: para bioreactores en gran escala, la transferencia de oxígeno es mejor que en una escala laboratorio ó un reactor de planta piloto. Esto se debe a una contribución > de la fase gaseosa (velocidad superficial del gas superior), y una fuerza impulsora más grande (presión en el espacio de cabeza alta y una presión hidrostática de cabeza. La mayoría del oxígeno es transferido en la región cerca del agitador. El caldo pasa a través del agitador hacia fuera y adentro del cuerpo del reactor y regresa de nuevo al agitador, se consume más oxígeno de lo que se transfiere y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuirá. En un reactor tanque agitado grande ese camino de circulación del líquido puede llegar a ser de 10 m. Con una velocidad de líquido de 1 m/seg, el tiempo de circulación será de 10 seg. En el peor de los casos (no existe transferencia fuera de la región del agitador), pasarán 10 seg antes de que el oxígeno vuelva a depleted en el loop. Por lo tanto la concentración de oxígeno en el compartimento del fondo debe ser alta para que la depletion de oxígeno que perjudicaría al estado microbiano y la velocidad de

34 formación de producto, sea evitada. Según la ecuación J a = k l a (C* - C), la velocidad de transferencia de masa será < porque la fuerza impulsora (C* - C) en el fondo del reactor es baja porque C* y C son altos. En un bioreactor grande la OTR tiene limitaciones máximas debido a las siguientes restricciones: Pueden haber dificultades de construcción mecánicas en fermentadores muy grandes (> 300 m 3 ). Además el transporte de líquido y el mezclado se vuelven muy lentos con respecto a la transferencia de masa y a la reacción, por lo tanto se ve afectada la velocidad de la reacción total. También hay limitaciones en el enfriamiento que se vuelven muy significativas. La potencia promedio de entrada no debe exceder los 5 kW m 3. Los microorganismos superiores pueden ser dañados en áreas donde el valor de potencia es localmente muy alto. Además los costos de energía y mantenimiento del motor también serán excesivamente altos. La presión correspondiente a la velocidad superficial de aire debe estar por debajo de 0.1 m/seg. Los costos del compresor también son restrictivos y un hold up alto de aire aumentará con el costo del espacio que ocupe el caldo de fermentación en el reactor. La presión en el espacio de cabeza tiene un máximo por razones mecánicas. Además la presión parcial de CO 2 aumentará inhibiendo al crecimiento y a la producción. La fase gaseosa no se puede considerar idealmente mezclada. La presión parcial

35 de oxígeno cae a medida que las burbujas viajan a través del reactor, y esto reduce la fuerza impulsora para la transferencia de masa. En reactores más grandes que 10 m 3, el proceso de transporte de líquido y masa se vuelve lento. La transferencia de masa y circulación del líquido interfieren entre sí, por lo tanto deben ser tratadas juntas. En un reactor tanque agitado con un único agitador, la mayoría de la transferencia de oxígeno tiene lugar en la zona del agitador. Scale down : los microorganismos pueden experimentar cambios continuamente cuando viajan a lo largo de un bioreactor grande, esto puede producir efectos indeseables. Para evitar estos problemas la escala grande se toma como un punto de referencia, y los efectos posibles se estudian por simulación de las variaciones sufridas en la escala grande en una escala experimental pequeña. Factores limitantes de la escala grande como transferencia de masa, se llevan a una escala menor, se estudian y se los minimiza de una forma práctica y económica. Hay algunas herramientas adecuadas para encontrar soluciones adecuadas al down – scaling: Se usan dos reactores imitando las dos zonas más importantes de un reactor, y la recirculación del caldo entre esas dos zonas. El tamaño de los compartimentos y la velocidad de recirculación son críticas, igual que el tipo de flujo en cada reactor. Por Ej. Se va desde un flujo bien mezclado a un flujo pistón.

36 El desarrollo y verificación en gran escala de modelos de flujo matemáticos para tanques grandes se llevan a cabo y luego se usan para diseñar el experimento en la escala menor. Se usan sistemas de ensayo microbianos bien caracterizados, en los cuales la sensibilidad a variaciones seleccionadas son conocidas. Esto se ha estudiado extensivamente para mejorar la transferencia de oxígeno y el mezclado del sustrato que se usa como alimentación en reactores grandes.

37 Transferencia de oxígeno gas - líquido Debido a la importancia de los procesos de fermentación aeróbicos, la transferencia de masa gas – líquido es casi un sinónimo de la transferencia de oxígeno desde las burbujas de gas a un medio líquido. Como la velocidad volumétrica de transferencia de masa es proporcional a la diferencia entre la concentración de equilibrio (saturación) c* 0 y el valor real de la concentración de oxígeno disuelto en el medio c 0, es necesario conocer la concentración de saturación. La solubilidad del oxígeno disminuye a medida que aumenta la temperatura, y disminuye con la concentración de varios solutos presentes en el medio. Solubilidad del oxígeno en agua pura a una presión de oxígeno de 1 atm

38 Solubilidad del oxígeno a 25 ºC a 1 atm de presión en varias soluciones acuosas

39 Métodos para la determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa para el oxígeno Método directo : La mayoría de los procesos de fermentación aeróbicos están equipados con analizadores de oxígeno y electrodos para medir la concentración de oxígeno disuelto. Se mide el contenido de oxígeno a la entrada y a la salida junto con la velocidad de flujo del gas, si es posible se trabaja en condiciones de flujo estacionario y se determina la velocidad de transferencia de oxígeno volumétrico, q t 0, el cual en ee es igual a la velocidad de consumo volumétrico –q 0. Así tenemos la ecuación siguiente: R: cte de los gases J / mol ºK ó l atm / mol ºK, T (ºK), p 0 es la presión parcial de oxígeno, y v g es la velocidad de flujo de gas. La mayoría de los analizadores dan el resultado como una fracción de moles de oxígeno en el gas. Cuando se usa aire normal, es suficiente analizar solamente la composición del gas a la salida. Sin embargo para bioreactores grandes es importante tener en cuenta la diferencia de presión a lo largo del reactor. Si se mide también la concentración de oxígeno disuelto, c 0 en el medio, se puede calcular k l a de:

40 Suposiciones La concentración de saturación c* 0 es la misma a través del reactor. La diferencia de presión es pequeña y que la disminución en la presión parcial de oxígeno en la fase gaseosa es pequeña, si no es este el caso se debe usar la ecuación para la fuerza impulsora de la concentración: Este es un método simple y el que tiene una ventaja mayor para aplicarse en fermentaciones reales. Sin embargo se deben conocer medidas seguras del contenido de oxígeno, de las velocidades de flujo de gas y de la solubilidad del oxígeno en el medio. Además la tensión de oxígeno no debe cambiar durante la medida, ya que suponemos estado estacionario ó pseudo estacionario como un requerimiento estricto.

41 Método dinámico : se basa en la medida de la concentración de oxígeno disuelto en el medio. No requiere de medidas de la composición del gas, por lo tanto es un método barato. El balance de masa dinámico para la concentración de oxígeno disuelto es: Si se corta el suministro de gas, q t 0 es cero y el primer término del lado derecho de la ecuación cae a cero. La concentración de oxígeno disuelto disminuye a una velocidad igual a la velocidad de consumo de oxígeno, - q 0 que puede por lo tanto determinarse midiendo la concentración de oxígeno disuelto c 0 (t). Si q 0 es independiente de c 0 la concentración de oxígeno disuelto disminuye como una función lineal con el tiempo. Cuando se restablece el suministro de gas, la concentración de oxígeno disuelto aumenta de nuevo al nivel inicial, y usando el valor promedio estimado para q 0, se puede determinar el valor de k l a midiendo el perfil de oxígeno disuelto. El método es simple y puede aplicarse durante una fermentación real. Exige que q 0 se determine correctamente cuando se corta el suministro de gas. La mayoría de los electrodos para medir la concentración de oxígeno disuelto, desafortunadamente tienen un tiempo de respuesta próximo al tiempo característico para el proceso de transferencia de masa, y por lo tanto las concentraciones medidas están influenciadas por la dinámica del aparato de medida, Ej un electrodo de oxígeno.

42 El método dinámico puede aplicarse para condiciones donde no hay reacción (q 0 es cero). Esto es interesante cuando se estudia la influencia de parámetros operativos, Ej: velocidad de agitación y velocidad de flujo de gas, sobre el coeficiente volumétrico de transferencia de masa en un medio modelo. Después de una etapa de cambio en la concentración a la entrada del gas, hay cambios dinámicos en la concentración de oxígeno disuelto y en la concentración de oxígeno a la salida. Debido a la dinámica baja de los electrodos de oxígeno, es preferible aplicar medidas del gas agotado para la determinación del coeficiente de transferencia de masa. (Se debe usar un balance de masa para el oxígeno en la fase gaseosa). Sin embargo antes de aplicar esto es importante chequear con cuidado la dinámica del analizador de gas. Método del sulfito : Es posible determinar la transferencia de oxígeno usando un modelo de oxígeno que se consume en una reacción química. El método tradicional del sulfito se basa en la oxidación de sulfito a sulfato por el oxígeno: La reacción es catalizada por un nº de iones metálicos, que pueden ser impurezas. Sin embargo se agrega una cantidad conocida de Cu (10 -3 M) ó sales de Co para hacer la reacción casi instantánea. Así la velocidad de consumo del sulfito se determina solamente por la velocidad a la cual el oxígeno es transferido desde la fase gaseosa.

43 De la ecuación anterior se tiene que: Consideramos: La concentración de oxígeno disuelto, c 0 es cero debido a que la reacción con el sulfito es muy rápida. La velocidad de reacción se determina midiendo la concentración de sulfito en muestras que se toman a intervalos de tiempo una vez iniciada la reacción. La concentración de sulfito en las muestras se determina agregando yodo en exceso, por lo tanto se hace una titulación por retroceso con tiosulfato de sodio, usando almidón como indicador. Las reacciones son las siguientes: Para aplicar el método, es necesario conocer la concentración de saturación de oxígeno en una solución de sulfito concentrada, como esto no se conoce se usa la solubilidad del oxígeno en soluciones de sulfato, que es 1.02 mM a 25 ºC para una solución 0.25 M de sulfato. Este método es simple de usar pero tiene una serie de desventajas: La oxidación del sulfito puede aumentar la absorción de oxígeno, ya que la

44 reacción rápida puede ocurrir no solamente en el volumen de líquido sino también en la película líquida. La suposición de un perfil lineal de concentración es por lo tanto cuestionable Otra complicación es el efecto de coalescencia reducida del sulfito en el volumen de líquido, que resulta en un área interfacial específica más grande. Ambos, el aumento de transferencia de masa debido a la reacción en la película, y a los efectos de coalescencia reducida del sulfito, pueden conducir a una sobreestimación del valor de k l a comparado al que se encuentra en un medio de fermentación normal. Esto es una desventaja significativa del método. Este método no se puede aplicar a una fermentación real, ya que los microorganismos morirían. Método del peróxido de hidrógeno : es un método químico como el sulfito pero tiene algunas ventajas sobre este. En este método se mide la transferencia de oxígeno desde el líquido a la fase gaseosa. El oxígeno es generado por la descomposición de H 2 O 2 catalizada por una enzima según: La reacción es de primer orden con respecto al agua oxigenada y a la enzima catalasa. Pasa un flujo volumétrico constante de aire, y después de la adición de una cantidad conocida de enzima, se alimenta en forma continua agua oxigenada al reactor.

45 Inicialmente el peróxido de hidrógeno se acumulará en el medio del reactor hasta que se establece el estado estacionario, entonces la velocidad de descomposición del peróxido de hidrógeno –q ag ox es igual a la mitad de la velocidad de transferencia de oxígeno de la fase líquida a la fase gaseosa: Notar que ambos términos de esta ecuación son negativos, porque el oxígeno se genera en el líquido. La velocidad volumétrica de descomposición del peróxido de hidrógeno se calcula de la velocidad volumétrica de adición y de la concentración de peróxido de hidrógeno en el líquido agregado, de acuerdo a: La concentración interfacial de oxígeno se calcula a partir de la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa. (DOT = c 0 / c* 0 > 1) Es necesario suponer mezclado de la fase gaseosa para determinar la concentración interfacial de oxígeno. Hickman suposo mezclado completo de ambas fases gaseosa y líquida, que da:

46 Este método es fácil de implementar. Para estimar el valor de k l a se debe medir la velocidad de adición del peróxido de hidrógeno y la concentración de oxígeno (DOT) en la fase líquida. Una medida independiente (pero mucho menos segura) de q t 0 es obtener de la diferencia en contenido de oxígeno entre v in g y v out g como en el método directo. Comparando con el método del sulfito, una ventaja significativa es que el valor de k l a no aumenta por la concentración de la catalasa en un rango bastante amplio. El riesgo de aumentar la transferencia de masa debido a la reacción en la película líquida es muy pequeño, y el efecto de propiedades por coalescencia por la catalasa también es muy pequeño. Este método se puede aplicar con buenos resultados para medir k l a en reactores de escala industrial y también con fluídos viscosos y medios no Newtonianos.

47 Métodos por trazadores : 85 Kr es un isótopo volátil que emite radiación beta y gamma. Se inyecta el isótopo en el medio y luego se mide la radioactividad en el gas agotado, es posible determinar el coeficiente volumétrico de transferencia de masa para Kr. Se supone que existe una relación constante entre los valores de k l a para diferentes gases en las mismas condiciones, el valor estimado de k l a para Kr se usa para calcular el valor correspondiente de k l a para el oxígeno. Pedersen et al: Aproximadamente se encuentra el mismo valor si uno usa la relación entre los coeficientes de difusión molecular para las dos especies: Este método es fácil de implementar, y es bien apropiado para medir ambos, medios modelos y bajo condiciones de fermentación real. La principal desventaja es la radioactividad, que obviamente limita su aplicación en la industria a pesar de que el isótopo es muy volátil y la radiación baja a los pocos minutos de su inyección. Kr es completamente inerte en conecciones con fermentaciones.

48 Transferencia de Masa Convectiva Forzada Grupos Adimensionales – Conceptos Generales A menudo se requiere un mezclado mecánico vigoroso para obtener velocidades de biomasa crecientes, de consumo de sustrato ó de formación de producto. Las funciones que rigen la agitación mecánica (y en algunos casos son dominantes) que influyen sobre el flujo convectivo de las burbujas que suben libremente ó que caen dispersadas son: La presión dinámica alta cerca de la punta del agitador ó en otros aparatos que producen burbujas pequeñas, aumenta con el área, a´. El fluído de fermentación puede contener una suspensión de sólidos u otra fase líquida, que tiende a subir ó caer en el tanque. Los agitadores mecánicos proveen una dispersión volumétrica uniforme de estas dos fases. Para burbujas de gas de un dado tamaño vigorosamente agitadas, k l no varía significativamente con la potencia de entrada, ya que la velocidad relativa del gas ó del fluído es dominada por las diferencias de densidad. En agitación turbulenta, D disminuye y aumenta a´para un hold up dado. Cambian el tamaño de las burbujas y k l, según D. El tamaño de micelios, slimes microbianos, pellet de hongos, etc disminuyen con la agitación. Se puede obtener un < rendimiento de producto a velocidades de agitación altas por daños celulares ó a enzimas extracelulares.

49 La suspensión líquido – células puede ser viscosa tal que únicamente una agitación mecánica provea un mezclado en todo el volumen del medio. En convección forzada, la acción de un trabajo mecánico aplicado produce una velocidad característica con otros movimientos que pueden ser escalados. Para agitación mecánica existen dos factores: la fluctuación de la velocidad del fluído u, y la velocidad de punto del agitador u i que es proporcional a N i D i, donde N i es la velocidad de rotación del agitador en revoluciones por unidad de tiempo, y D i es el diámetro del agitador. Considerando los balances de convección forzada para la masa total, especies, y momentos producen los grupos adimensionales siguientes, consideramos u como la velocidad característica:

50 Alternativamente en sistemas agitados, la dimensión característica es el diámetro del agitador D i, y la velocidad de referencia es N i D i. El subídice i hace referencia al cambio de escala. El nº de Froude tiene también otras definiciones. Para transferencia de masa en una suspensión de partículas buoyant neutrlmente,es: L es la longitud del reactor. Como el nº de Froude representa la contribución de la dinámica de la superficie libre vs el mezclado mecánico, la distancia de la superficie del fondo del tanque el nº de Froude debe considerarse. Cuando tengo dos fases, el nº de Froude es:

51 Cambio de Escala Los procesos de producción por microorganismos son seleccionados primero en el laboratorio, bajo condiciones diferentes de aquellas de la producción en gran escala. El microorganismo se prueba en un nº de bioreactores de volumen mayor, y la verificación del proceso final se lleva a cabo en una planta piloto (50 l a 3000 l). La operación de cambio de escala cambia significativamente cuando el cultivo proviene de una caja de Petri ó de un cultivo en erlenmeyer a un reactor de escala pequeña. El cambio de escala no involucra solamente consideraciones de ingeniería pura, sino también consideraciones económicas. Los fenómenos necesarios a tener en cuenta en un cambio de escala se dividen en procesos físicos (fenómenos de transporte) y proceoso metabólicos (cinética microbiana). Se modela el reactor para el cambio de escala de acuerdo al esquema siguiente:

52 Los procesos físicos se describen mediante modelos matemáticos de complejidad variable, se hace por ingeniería química ó mecánica clásica. Los fenómenos metabólicos son dependientes de la escala. Como consecuencia de los fenómenos de transporte, el entorno de la célula varía mucho en un bioreactor en escala grande a uno en escala pequeña (reactor bien mezclado). Representación esquemática de los pasos que se deben analizar en un cambio de escala

53 Estos cambios de entorno pueden causar cambios metabólicos, las concecuencias son impredecibles, debido a la insuficiencia de datos experimentales.

54 Bioreactores Requerimientos básicos y tipos de reactores Se desea obtener un rendimiento de producto alto, productividad alta, y también reproducibilidad alta. La mayoría de los bioreactores están dentro de las categorías siguientes: tanques no agitados, tanques agitados, reactores air – lift, reactores de membrana, lechos fluidizados ó lechos empaquetados. Los tipos de reactores difieren principalmente con respecto al modo de agitación y aireación. En reactores agitados mecánicamente, el mezclado se hace con agitadores internos, en cambio en reactores agitados neumáticamente el flujo se alcanza por aireación solamente. En reactores loop, parte del medio es continuamente withdrawn por medio de una bomba. La aireación, la adición de sustrato y la transferencia de calor se ubican en el loop externo.

55 a)Reactor tanque agitado b)Columna de burbujas c)Reactor air lift d)Reactor de lecho empaquetado e)Reactor loop con circulación externa, e intercambiador de calor

56 Hay varios tipos de agitadores, sus características varían de acuerdo al tipo de flujo, a la capacidad que tengan para agitar una suspensión ó para dispersar. Se distinguen dos tipos principales de agitadores: los agitadores de flujo axial (propeller) y los de flujo radial (agitadores turbina de hojas planas). El diámetro del agitador es 1/3 del diámetro del reactor (turbina Rushton), mientras que para fluídos foil, el diámetro del agitador puede exceder a la mitad

57 del diámetro del tanque. Carácterísticas de los agitadores CaracterísticasPropellerTurbina de Disco Dirección de flujoAxialRadial Gassingmenos apropiadomuy apropiado Dispersarmenos apropiadomuy apropiado Suspendermuy apropiadomenos apropiado Mezclar muy apropiadoapropiado La aireación tiene lugar introduciendo aire (oxígeno) por medio de un distribuidor colocado debajo de los agitadores. Consiste de un tubo abierto, ó un anillo con orificios muy finos (de diámetro algo menor al del agitador). La relación entre la velocidad de flujo de aire, v g, y el área de sección transversal del reactor se llama velocidad superficial del gas, u s. La velocidad superficial del gas no debe ser muy grande, para asegurar una dispersión eficiente y utilización del gas. A velocidades superficiales del gas demasiado altas, el agitador está completamente rodeado del gas, y la capacidad de dispersión cae dramáticamente. Este fenómeno se llama flooding.

58 Procesos Físicos de Importancia en un Cambio de Escala Hay un nº de factores físicos que cambian en un cambio de escala del reactor. Estos problemas se resuelven con ecuaciones de movimiento para el fluído en el reactor. Enfocaremos modelos simplificados para ilustrar los cambios esenciales que ocurren con respecto al: mezclado, consumo de potencia, transferencia de calor, transferencia de masa y patrones de flujo en reactores tanque agitados como cambios de escala. Mezclado Se entiende como mezclado el proceso para alcanzar uniformidad. Se divide en el nº de fases involucradas en el proceso de mezclado: Mezclado de una única fase líquida, mezclado líquido – líquido, mezclado gas – líquido, mezclado sólido – líquido, y mezclado de tres fases. Un bioreactor generalmente contiene tres fases por lo que no se puede alcanzar uniformidad en una escala micro. Sin embargo con velocidades de agitación muy altas, la concentración en las fases líquida y gaseosa puede ser aproximadamente constantes en el volumen del reactor. La suposición de mezclado perfecto es válida para escala pequeña (1 – 2 l) en reactores que son agitados intensamente, con tiempos de mezclado del orden de 1 seg, ya que la mayoría de los procesos biológicos son procesos relativamente lentos a temperaturas de 30 a 40 º C.

59 En sistemas de escala grande, el tiempo para alcanzar homogeneidad en el reactor puede ser del orden de minutos, por lo que no se puede despreciar. El mezclado se alcanza por un flujo de convección ó sea la distribución causada por el patrón de flujo principal en el reactor (macromezclado). Y en el micromezclado el tamaño se alcanza por difusión molecular. Una forma de cuantificar el mezclado es por ej. agregar un colorante al reactor y monitorear el regreso gradual a la homogeneidad. El grado de mezclado ó grado de homogeneidad, m, se usa cuantitativamente para describir este experimento y se define como: Donde s(t) es la concentración del trazador a tiempo t, s 0 es la concentración inicial, s infinito es la concentración para t tendiendo a infinito, donde m se aproxima a 1. El tiempo de mezclado se define como el tiempo necesario para obtener un valor de m más grande que un valor específico threshold. Este es un valor arbitrario (0.95 a 0.99). Algunos investigadores consideran que el mezclado se asemeja a un proceso de primer orden. Por lo tanto el tiempo de mezclado será la inversa de una constante de velocidad de primer orden, es conveniente comparar la velocidad de mezclado con la velocidad de transferencia de masa, ó la velocidad de la reacción.

60 Para un sistema de una fase desarrollado en un tanque agitado con bafles, el tiempo de mezclado es inversamente proporcional a la velocidad del agitador, N (seg -1 ). La velocidad del agitador se expresa en rpm, rotaciones por minuto. La constante de proporcionalidad depende del tipo del agitador. Otra característica que depende del tipo del agitador es la capacidad de bombeo, v pump, que se define como el volumen de líquido que es expulsado desde el agitador por unidad de tiempo (m 3 / seg). d s es el diámetro del agitador (m). La constante de proporcionalidad se llama Número de flujo, N f, y depende del tipo del agitador y la viscosidad del medio. El tiempo de circulación, t c (seg), se define como:

61 t m es proprcional a t c en un reactor de flujo turbulento completo. Potencia Consumida El proceso de mezclado requiere energía. La potencia de entrada, P (W), en un tanque agitado consiste de dos partes, la potencia para agitar y la potencia de compresión para la aireación. Para reactor tanque agitado el 1º término es lo importante, y para una columna de burbujas como un reactor air – lift lo es el segundo.Además se requiere de una energía adicional para la circulación del líquido, por ej: con bombas externas. La potencia de entrada es de costo mayor en procesos aeróbicos, y esto depende de varios factores: velocidad de agitación, N, diámetro del agitador, d s, densidad del fluído, ρ l (kg / m 3 ), y la viscosidad del fluído, η (kg / m seg) es la viscosidad dinámica. Por análisis dimensional es posible combinar estos factores en nº adimensionales, el consumo de la potencia para agitar se expresa como una función de un nº adimensional, N p (nº de Newton), N p también se expresa como una función del nº de Reynolds, que se definen como:

62 La variación de N p con el Re s, se observa en la figura siguiente. El flujo en un reactor tanque agitado es completamente turbulento, para un Re s > En un reactor con bafles, sólo las fuerzas inerciales son importantes para un flujo turbulento, N p tiene un valor constante de Re s. En régimen de flujo laminar, Re s < 10, las fuerzas viscosas dominan y la disipación de la potencia dependerá del Re s.

63 Para flujo laminar el N p es: Entre flujo laminar y turbulento hay una zona de transición, en la cual hay que considerar las fuerzas inerciales y viscosas. Para N p conocido, la potencia consumida se calcula como: (para un único sistema de agitadores) Para múltiples agitadores se puede calcular la potencia de entrada multiplicando la potencia consumida por el nº de agitadores, pero esto es una sobre estimación, ya que la potencia consumida aumenta suavemente menos y proporcional a nº de agitadores.

64 Influencia de la aireación La potencia consumida para la agitación está afectada por la aireación. Cuando se dispersa el gas en el tanque, las burbujas se van hacia regiones de baja presión, entonces se forman áreas llenas de gas, que se llaman cavidades cerca de las hojas del agitador. La formación de estas cavidades depende de la relación entre la velocidad volumétrica del flujo de gas y la capacidad de la bomba. Esta relación se expresa como un grupo adimensional, llamado número de aireación N A : N f es el nº de flujo v g : flujo de gas (m 3 / hr) v pump :flujo inducido por el agitador (m 3 / seg) Las cavidades crecerán con el aumento de N A hasta que el agitador está completamente inmerso en el gas, una condición que se llama flooding. El N p,g cae gradualmente con el aumento de N A, tal como se muestra en la figura siguiente.

65 Una correlación empírica que describe la relación entre P g, y P no aireada, es el consumo de potencia:

66 El valor de k depende del tipo de agitador. Potencia de entrada en una columna de burbujas: es normalmente pequeña en reactores tanque agitado, además la energía para el mezclado es suministrada por la aireación. La potencia de entrada de compresión que opera auna velocidad superficial moderada es: g: es la aceleración de la gravedad (9.82 m / seg 2 ) u s : velocidad superficial del gas (m / seg) V: volumen (m 3 ) Cambio de Escala y Transferencia de Masa El problema es describir la velocidad de transferencia de masa desde la fase gaseosa a la fase líquida. El valor de k l a depende de la potencia específica de entrada, P/V, y la velocidad superficial del gas, u s, y se expresa con la ecuación siguiente: (1)

67 k: constante de velocidad (ej: kg / kg hr) α y β: coeficientes empíricos V l :volumen de líquido (m 3 ) Esta correlación se debe usar con cuidado para estimar la transferencia de masa en diferentes escalas. Es válida únicamente cuando el agitador no está totalmente sumergido en el gas. Como consecuencia de un cambio de escala la relación entre velocidad de aireación y volumen de líquido puede cambiar. La velocidad de aireación se expresa vvm (volumen de gas por volumen de líquido por minuto). La velocidad superficial del gas aumenta con V 1/3 para un mismo valor de vvm. Si excede a la velocidad ascensional de la burbuja, u b (depende fuertemente de la viscosidad), ocurrirá flooding. Para un caldo viscoso u b se estima alrededor de 0.2 m/seg. Casi para una velocidad superficial del gas que se aproxime en un 25 – 50 %

68 de la velocidad ascensional de la burbuja, el flooding es probable que ocurra. Por lo que la velocidad superficial del gas debe mantenerse por debajo de 0.05 m/seg para asegurarnos de evitar el flooding en los caldos similares al agua. Superficie de aireación La transferencia de oxígeno al líquido no se debe únicamente a las burbujas dispersadas, sino también vía superficie. En reactores de escala pequeña (< 50 l), la contribución de la transferencia de oxígeno en la superficie es muy significativa, mientras que para reactores grandes se puede despreciar. En la ecuación (1) los exponentes α y β disminuyen aumenta el tamaño del reactor. Disipación de la potencia no constante Es espacialmente no homogénea, es mucho > cerca del agitador (por un factor de 100). Se debe a diferencias en la distribución del tamaño de burbujas, hay burbujas pequeñas cerca del agitador y más grandes cerca de la pared, sobre todo en medios coalescentes. Estas correlación nos da un valor de k l a < que en escala pequeña. Gradientes de otros compuestos distintos al oxígeno La transferencia de masa en todo el volumen de líquido no es instantánea, ej, la suposición del tanque ideal no es válida. Cuando aumenta el t c se producen gradientes para cualquier componente que se agrega durante la operación. Por ej ocurre cuando se agrega una base para el control de pH.

69 En procesos continuos ó fed – batch los gradientes ocurren también para otros componentes del medio, ej: cuando se agrega una fuente de carbono. Reología de los Caldos de Fermentación El patrón de flujo en un reactor tanque agitado se determina por el reactor y la geometría del agitador, la potencia de entrada al sistema y las propiedades del fluído. Reología es el estudio del flujo y la deformación de la materia. Un fluído se define como una fase material que no puede sustain fuerzas de corte, ej: fuerzas que actúen en una dirección tangencial a la superficie, (las fuerzas que actúan en dirección normal a la superficie son las fuerzas de presión). Un fluído responderá a fuerzas de corte deformándose continuamente, ej por flowing. La velocidad de corte, γ (seg -1 ) en un flujo de dos dimensiones se define como: γ= du y / dz donde Z es la dirección perpendicular a la dirección del flujo. Newton estableció que la resistencia (esfuerzo de corte) que se origina en un fluído, es proporcional a la velocidad por parte del fluído, que está siendo separado uno de otro (velocidad de corte). La viscosidad dinámica, η (kg m / seg), de un fluído es una propiedad fundamental que relaciona la fuerza de corte, τ (N / m 2 ), con la velocidad de corte según: τ = - η γ

70 No se debe confundir la viscosidad dinámica con la viscosidad cinemática que es la relación entre la viscosidad dinámica y la densidad del fluído (m 2 / seg). Para fluídos Newtonianos, la viscosidad es independiente de la velocidad de corte. Para fluídos no Newtonianos es una función de la velocidad de corte. El agua y muchos caldos de fermentación se pueden considerar como fluídos Newtonianos. En cambio las fermentaciones de hongos filamentosos ó donde se excretan polímeros, tienen un comportamiento no Newtoniano.

71 Comportamiento no Newtoniano El más importante es cuando la velocidad de corte depende de la viscosidad. Un fluído cuya viscosidad disminuye cuando aumenta la velocidad de corte se llama pseudoplástico. Lo opuesto, es decir aumenta la viscosidad cuando disminuye la velocidad de corte se llama dilatante. Las soluciones de polímeros y soluciones que contienen hongos filamentosos son a menudo pseudoplásticos. Ciertos materiales no fluyen hasta que se excede tres veces el esfuerzo de corte, estos materiales se llaman plásticos de Bingham. Una relación típica entre la velocidad de corte y viscosidad es el Modelo de OSTWALD ó power law model. η = K γ n-1 K es el índice de consistencia n es el índice de la ley de potencia. Si n > 1, el fluído es dilatante, si n < 1 es pseudoplástico, y si es n = 1 es un fluído Newtoniano. Un medio que contiene microorganismos es normalmente Newtoniano, y la viscosidad es cercana a la del agua pura (excepto cuando tengo [biomasa] muy altas. Si el microorganismo produce polisacáridos extracelulares, hay un efecto significativo sobre la reología, pero el efecto sobre las células es despreciable.

72 En fermentaciones de hongos, el medio se vuelve muy viscoso. Las propiedades reológicas van a depender si tengo micelio libre ó aglomerado de hifas, de la forma de los pellets. Generalmente el esfuerzo de corte y la viscosidad en un medio con micelio es > que en un medio con pellets a la misma [biomasa]. Cambio de Escala en la Práctica Es imposible mantener las mismas condiciones de una escala laboratorio ó planta piloto a una escala >. En la Tabla 1 se mantuvieron constantes 4 parámetros, potencia de entrada específica, velocidad de agitación (que es equivalente a mantener el tiempo de mezclado), la velocidad de punta (que da aproximadamente la misma velocidad de corte, y el nº de Re, el resto de los parámetros se modifican con el cambio

73 de escala. Hay cuatro aproximaciones diferentes para un cambio de escala: Método Fundamental Métodos semi fundamentales Análisis dimensional Reglas de Thumb El método fundamental se basa en la solución de ecuaciones que gobiernan el flujo combinadas con la cinética de la reacción. En un sentido estricto, esto no es posible ya que la cinética microbiana no es del todo conocida, se deben hacer suposiciones. En el método semi fundamental se aplican modelos de flujo más simples. Cuando un modelo se combina con un modelo cinético apropiado, se puede describir con precisión el proceso. Por ej: un modelo estructurado. Análisis dimensional se basa en la comparación de los tiempos característicos de mecanismos diferentes involucrados en un proceso de fermentación. Para un proceso que se modela como de primer orden, el tiempo se define como la recíproca de la velocidad constante. Para procesos que no son de primer orden, el tiempo se calcula como la relación entre la capacidad y el flujo (contenido volumétrico de la especie considerada vs velocidad volumétrica de la especie consumida).

74 Analizando los tiempos característicos se pueden identificar problemas como limitación de oxígeno en un proceso en gran escala. ε: hold up del gas (m 3 de gas / m 3 de la dispersión del gas en el líquido) v g : flujo de gas (m 3 / hr) q s : velocidad volumétrica de sustrato (kg / m 3 hr) v f : líquido de alimentación del reactor (m 3 / hr) s f : [S] en la alimentación (kg / m 3 )

75 Pasos principales en un cambio de escala Reglas de thumb En la Tabla 1 se puede mantener constante un parámetro durante el cambio de escala, lo más usado es potencia de entrada del agitados y el valor de k l a. En la práctica no es así porque los valores pueden cambiar, inclusive puedo diseñar un reactor completamente diferente. Si se sigue los pasos esquematizados para un cambio de escala puedo evitar fallas asociadas con el mismo.

76 Fermentación en estado sólido (FES) Antecedentes Los procesos de FES existen de manera natural desde el comienzo de la vida en el planeta y fueron empleados de forma artesanal en los países del Sudeste Asiático, África y América Central desde hace siglos para la elaboración de alimentos a partir de cereales, yuca, entre otros. El objetivo fundamental con estas fermentaciones ha sido no solo aumentar el contenido proteico de estos alimentos, sino mejorar las posibilidades de conservación, cambiar las características físicas, el color, el olor o el sabor de los mismos. Ejemplos de estos productos lo constituyen el Koji, que se obtiene por el cultivo del hongo Aspergillus oryzae sobre cereales cocidos, el Shoyu, el Miso y el Ontjom (Hesseltine, 1972). La producción del queso Roquefort a partir de leche de oveja, data de alrededor de 1000 años; sin embargo, no es hasta aproximadamente 1930 que se conoce el papel de los hongos en la elaboración de ese alimento, cuando se demostró que todos los hongos desarrollados en este tipo de queso eran del mismo organismo Penicillium roqueforti. No es hasta finales de la década de los 70 que se promueve con fuerza el estudio científico, con vistas a aprovechar las ventajas económicas de este tipo defuerza

77 fermentación (Doelle y col., 1992). Definición Hesseltine (1972) empleó el término de fermentación en estado sólido a todas las fermentaciones donde el sustrato no es líquido. Posteriormente, Raimbault (1980) propuso un término más preciso: "Las fermentaciones en las cuales el sustrato no está ni disuelto ni en suspensión en un gran volumen de agua". No obstante, Moo-Young y col. (1983), propusieron un término a todos los procesos que utilizan materiales insolubles en agua para el crecimiento de microorganismos en ausencia de agua libre. Aautores como Mudgett (1986) y Durand. y col. (1988), han planteado una definición más general: "Es un método de cultivo de microorganismos sobre y/o dentro de partículas sólidas". El líquido ligado a las partículas sólidas debe estar en una cantidad que asegure la actividad del agua adecuada para el crecimiento y el metabolismo de los microorganismos, pero sin exceder el máximo poder de retención de este líquido en la matriz sólida. La definición más general y reciente fue formulada por Viniegra-González (1997), donde se plantea que "es un proceso microbiológico que ocurre comúnmente en la superficie de materiales sólidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin nutrientes solubles".

78 Esta definición abarca a procesos donde el soporte sólido es inerte y los sustratos que utiliza el microorganismo pueden ser sustancias solubles en agua, como el proceso de bioconversión de etanol y el crecimiento de Candida utilis sobre amberlita (Christen y col., 1993). Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido comparada con el cultivo sumergido en líquido Doelle y col. (1992) consideran como ventajas los siguientes aspectos: Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios. La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, especialmente de bacterias y levaduras. La concentración natural del sustrato permite utilizar reactores más pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de fermentación. Tienen mayor productividad volumétrica. La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de oxígeno al microorganismo. Pueden emplearse, frecuentemente conidios como inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos y las manipulaciones en la preparación del inóculo.

79 Los conidios de los hongos que se producen son mucho más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se aplican como agente de biocontrol. El proceso de recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados integralmente, como alimento animal, productos para el control biológico, etc. Los procesos se consideran generalmente como tecnologías limpias. Entre las principales desventajas se encuentran: Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos de humedad. La extracción del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se trabaja a gran escala y no se controla el proceso. La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los parámetros de la fermentación tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la concentración de sustrato y productos. Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión. Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado están muy poco caracterizados.

80 El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de crecimiento. Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son relativas, por ejemplo, el tiempo de fermentación ya que actualmente se están empleando bacterias en los procesos de FES. Autores (Ballio y col y Richard-Molard y col. 1985), demostraron que durante el desarrollo del cultivo de un hongo, la variación de la actividad del agua (a H2O ) en el medio, puede influir sobre el crecimiento micelial ó en la germinación de las esporas y esto es útil para optimizar la producción de conidios en fermentadores con sustrato sólido, donde la suplementación de oxígeno y la cosecha de conidios, resulta más fácil que en fermentaciones líquidas. Influencia de factores ambientales en la fermentación en estado sólido Las condiciones ambientales tales como la humedad, la actividad del agua, el pH, la temperatura, la concentración y disponibilidad del sustrato, la aireación, el tamaño de partículas y la forma de inoculación afectan significativamente tanto el crecimiento como la formación de productos. En el cultivo líquido agitado el control de las condiciones ambientales es relativamente simple, ya que estos sistemas son homogéneos desde el punto de vista de la concentración celular, nutrientes y productos.

81 Sin embargo se presentan problemas serios en los sistemas sólidos con el mezclado, la transferencia de oxígeno, el intercambio de calor y el control de la humedad y el pH, debido, principalmente, a la heterogeneidad y la consistencia del sistema (Doelle y col., 1992). La Humedad y la actividad del agua (a H2O ) El porcentaje de humedad en la fermentación sólida puede variar entre 30 y 80% (Oriol y col., 1988), dependiendo del sólido utilizado, el microorganismo y el objetivo del proceso (formación de producto, crecimiento de la biomasa). Aunque el porcentaje de humedad es una de las variables que comúnmente se optimiza en los sistemas de fermentación sólida, (Kim y col., 1985, Rodríguez y col., 1986), hoy se reconoce que no es solo la cantidad de agua presente en el sistema la que ejerce su influencia sobre la eficiencia del proceso, sino el carácter de las interacciones entre el agua y el medio sólido. La actividad del agua (a H2O ) es el parámetro que se ha utilizado para caracterizar cuantitativamente esas interacciones físicas y/o químicas del agua en el sistema. La actividad del agua se define como la humedad relativa de la atmósfera gaseosa en equilibrio con el sustrato (Oriol E. y col., 1988). La humedad relativa de un sistema gas - vapor de agua se determina por %H. R. = (p H2O / p° H2O ) 100, de manera que la actividad del agua es igual a la relación

82 entre la presión parcial del vapor de agua en la solución gaseosa (p H2O ) en el estado de equilibrio con el agua adsorbida en el sólido y la presión de vapor del agua pura (p° H2O ) a esa misma temperatura. Se demostró que la actividad del agua no sólo ejerce influencia sobre el crecimiento, sino también sobre la formación de productos y, en muchos casos, el valor mínimo requerido de a H2O para la formación del producto difiere del necesario para el crecimiento (Troller, 1980, Gervais y col., 1988). El pH El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los procesos de fermentación en estado sólido, al igual que lo hace en los cultivos sumergidos. Sin embargo, en el caso de la fermentación sólida, su control es prácticamente imposible, debido a la ausencia de instrumentos capaces de medir el pH en la capa de líquido que rodea el sólido (Mitchell y col., 2002). Por otra parte, el mezclado de sólidos es un proceso complejo por lo cual se dificulta también el control de esta variable durante el desarrollo de la fermentación. El pH cambia por diferentes razones; normalmente disminuye por la secreción de ácidos orgánicos como acético y láctico durante el proceso. No obstante, la fuente de nitrógeno utilizada influye mucho en la tendencia que sigue el pH (Domenech, 2000).

83 La temperatura El crecimiento y la formación de productos son resultados de complejas reacciones químicas, y al igual que cualquier otra reacción, están afectados por la temperatura, la que ejerce una acción determinante en el conjunto de actividades celulares. La temperatura es la variable cuyo control, en una fermentación sólida, se considera lo más crítico debido a la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y a la baja conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido - líquido - gas, lo que favorece la acumulación del calor metabólico en el sistema y un aumento de la temperatura del cultivo. El aumento de la temperatura favorece tres aspectos negativos: La actividad microbiana se desacelera o se detiene. Se deshidrata el medio sólido. El metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o ante la deshidratación (Gutiérrez y col., 1995). El control de la temperatura se ha tratado a través de métodos convencionales de extracción de calor y de métodos no convencionales. Los métodos convencionales incluyen el intercambio de calor por los mecanismos

84 de conducción y convección forzada. Se demostró que los primeros no son tan efectivos como los segundos (Saucedo - Castañeda y col., 1990). Los métodos de extracción de calor por convección, para ser efectivos, requieren de elevadas tasas de aireación que con frecuencia deshidratan al medio. Los métodos no convencionales se refieren a la utilización del calor latente de vaporización del agua para eliminar el calor metabólico de manera rápida y efectiva (Sargantanis y col., 1993). Existe un compromiso entre las soluciones drásticas y efectivas (métodos no convencionales) versus las menos efectivas (métodos convencionales) pero que respeten la integridad del sistema biológico en su conjunto. Resulta también claro que los sistemas de control de las FES deberán tomar en cuenta, simultáneamente, la humedad del medio, la humedad relativa del aire y la temperatura. También el tipo de reactor utilizado (con o sin agitación) juega un papel fundamental en la eficiencia del control de la temperatura. La concentración y disponibilidad del sustrato El medio de cultivo debe tener todos los nutrientes necesarios de forma balanceada para favorecer el crecimiento del microorganismo.

85 Las relaciones entre algunos de sus elementos son de particular importancia, por ejemplo, carbono-nitrógeno y fósforo-oxígeno, esta última de manera relevante en lo referido a la eficiencia de conversión energética y a la respiración (Cannel y Moo Young, 1980). La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir, debe establecer las concentraciones a ser utilizada de cada componente. Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas lo da el conocimiento de la composición de la biomasa del microorganismo empleado (Ertola y col., 1994). Mediante el conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y producto, y los valores de la energía de mantenimiento será posible establecer también los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio (Ertola y col., 1994). Al igual que en los cultivos sumergidos, la concentración de sustrato ejerce una influencia sobre el desarrollo del microorganismo. Hasta el momento, tal influencia no está caracterizada en términos de limitación o inhibición como en los cultivos sumergidos; pero se piensa que los efectos de limitación sean mayores en las fermentaciones sólidas, debido a la baja velocidad de difusión de los nutrientes en la fase líquida (Moo-Young y col., 1983). Si se ha encontrado que la relación carbono a nitrógeno tiene una gran

86 importancia y su valor óptimo puede variar en el intervalo de 10 a 100 en dependencia del proceso de fermentación. La aireación En la mayoría de los procesos de fermentación en estado sólido participan microorganismos aerobios, y resulta la aireación un factor fundamental para el desarrollo del proceso. La aireación se utiliza para suministrar el oxígeno necesario, para extraer el CO 2 formado, así como para extraer el calor metabólico evolucionado, de manera que el flujo óptimo de aire debe tomar en consideración la naturaleza del microorganismo utilizado, los requerimientos de oxígeno para el crecimiento y/o la formación del producto deseado, la velocidad de generación de calor metabólico, la concentración crítica del dióxido de carbono y otros metabolitos volátiles, el espesor de la masa de sólido, entre otros. La aireación en las FES es más fácil que las fermentaciones sumergidas, porque la superficie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las partículas (Viniegra y col., 2003). El tamaño de partícula El tamaño de partícula está muy ligado a la transferencia de masa en el sistema de fermentación en estado sólido, y para considerar este fenómeno se ha propuesto dividir el análisis en la transferencia de masa intrapartícula y la

87 interpartícula (Moo-Young y col., 1983). En el primer caso, influye más el tamaño y la forma del poro de la partícula, así como la porosidad, aunque también influye el tamaño de la partícula (Huerta, S., 1984). En el segundo caso, el espacio interpartícula es lo más importante y es afectado por el tamaño de la partícula, su forma y la humedad (Bernard y col., 1992). Otro aspecto que influye en la transferencia de masa durante el proceso, es el cambio de estructura de las partículas de sustrato resultado de la acción de los microorganismos (Moo-Young y col., 1983). El inóculo Otro factor que influye en los procesos de FES lo representa el tipo de inóculo y la forma de inoculación. En la literatura se reconoce el uso de dos tipos fundamentales de inóculo en la producción de hongos, tanto a nivel de laboratorio como industrial: micelio o esporas (Domenech, 2000). El uso de micelio está reportado por Moore y Prior (1993) y Jenkins y col. (1998), entre otros. Las principales ventajas del uso de micelio como inóculo son: una mejor competitividad del hongo, una reducción de la posible colonización del sustrato por microorganismos contaminantes y la colonización más rápida debido a que se reducen los tiempos de incubación (la fase de latencia o de adaptación principalmente).

88 Sin embargo, en diferentes trabajos se reporta el uso de suspensiones de esporas (Bosch y col., 1995, Dorta y col., 1996 y Booth y Shanks, 1998), destacándose su principal ventaja en la reducción de los costos en la etapa de propagación del microorganismo. Cinética y actividad metabólica del cultivo batch La cinética de un proceso; representa la variación de una o más variables de dicho proceso en el tiempo. En los procesos fermentativos las variables de mayor importancia y que más se han estudiado son: contenido de biomasa en el sistema, la naturaleza del sustrato, la síntesis de uno o varios metabolitos, el consumo de oxígeno y la producción de dióxido de carbono. Dentro de estas variables, la síntesis de biomasa en el proceso y el consumo de sustrato han permitido establecer una serie de criterios y parámetros que caracterizan cualquier proceso fermentativo (Domenech, 2000). Los estudios cinéticos permiten determinar aspectos tan importantes como: La velocidad específica de crecimiento El rendimiento del proceso. La productividad del sistema. El calor generado en el sistema.

89 La estrategia a seguir en cuanto a la producción de un metabolito específico. Una de las principales dificultades encontradas en el estudio y desarrollo de los procesos de fermentación en estado sólido viene dada por las características intrínsecas de estos sistemas heterogéneos, la imposibilidad del muestreo durante la fermentación para determinar las concentraciones correspondientes de biomasa, sustrato y productos. Este hecho se refleja de manera particularmente aguda cuando se tiene la necesidad de realizar estudios cinéticos del proceso. No obstante, existen diferentes alternativas que permiten desarrollar estos estudios de manera objetiva y satisfactoria. La determinación de la biomasa por métodos indirectos se ha empleado por diferentes investigadores. Entre ellos, Sato y col. (1983), Rodríguez y col. (1988), Desgranges y col. (1991) han basado su metodología en el metabolismo respiratorio. El O 2 consumido y el CO 2 producido son el resultado de los procesos metabólicos a través de los cuales los microorganismos aeróbicos obtienen la energía necesaria para su crecimiento. Por tanto, estas actividades metabólicas están asociadas al crecimiento del microorganismo y pueden usarse para estimar la biomasa sintetizada. Entonces es posible relacionar en términos diferenciales el O 2 consumido (dO 2 /dt)

90 y el CO 2 producido (dCO 2 /dt) tanto al crecimiento celular como al mantenimiento. Se usan modelos de correlación que son resueltos con el uso de técnicas numéricas para la solución de ecuaciones diferenciales. Con el empleo de computadoras y software adecuados y cromatógrafos o analizadores de gases (CO 2 y O 2 ) acoplados a la salida de los gases del fermentador, es posible estimar de forma continua la biomasa sintetizada y, de esta manera, estimar el calor metabólico generado. Esta metodología también podría aplicarse en el control de parámetros de la fermentación como, por ejemplo, para la temperatura. Consideraciones acerca de optimización de medios de cultivo Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativa la optimización de los medios de cultivo (Ertola y col., 1994). Entre ellas podemos mencionar las siguientes: La no existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado. La existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento. El uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los

91 requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento. El ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.ensayo El empleo de fuentes nutricionales no convencionales. Acerca de esto existen en la literatura diferentes ejemplos sobre técnicas que hacen posible la optimización de los medios de cultivo. La mayoría de estas, basan la formulación de los mismos en la composición elemental del microorganismo a estudiar o de otros similares que puedan servir de referencia para realizar un balance de materia apropiado. (Dreyer y col., 2000). La optimización de los medios de cultivo con fines industriales, en la mayoría de los casos ha sido efectuada mediante procedimientos empíricos de ensayo y error, no solo en la formulación del medio de cultivo, sino también en las condiciones de operación. De cualquier manera es probable que el medio de cultivo original pueda ser optimizado, modificando el porcentaje de los componentes del mismo y las materias primas utilizadas, siendo factible en muchos casos optimizar un medio de tal manera que no sea solamente más productivo, sino de menor o igual costo que el original, para lo cual se requiere del uso de varios métodos de optimización (Dreyer y col., 2000).

92 Un aspecto relevante en la optimización de un medio de cultivo de interés industrial no es sólo el logro de una formulación racional del mismo, sino también la posible inclusión de materias primas de bajo costo que hagan rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de subproductos de bajo valor comercial que puedan sustituir componentes costosos y que puedan ser utilizados como fuentes de carbono o nitrógeno (Dreyer y col., 2000).

93 Bibliografía Nielsen Jens, Villadsen John, Lidén Gunnar. Bioreaction Engineering Principles 2º Ed. Kluwer Academic / Plenum Publishers Ratledge Colin, Kristiansen Bjorn. Basic Biotechnology. Cambridge University Prees Crueger Wulf, Crueger Anneliese. Biotecnología: Manual de Microbiología Industrial Editorial Acribia Ing. Hector Correa Rivero MSc. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) La Habana. Cuba Bailey James E, Ollis David F. Biochemical Engineering Fundamentals. 2 ed. Mc Graw Hill. 1986


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