INTRODUCCIÓN A LA INSTRUMENTACIÓN

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA División de Estudios de Posgrado e Investigación
INTRODUCCIÓN A LA INSTRUMENTACIÓN “Métodos de Serigrafia para producción de Biosensores” “Tecnicas de Fabricación y miniaturización” Alumno: Ing. Juan Alberto Ramírez Quintana Docente: M.C. José Rivera Mejia CHIHUAHUA, CHIH. Lunes 14 Noviembre de 2005

CONTENIDO INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI
2. SCREEN-PRINTING MÉTODOS PARA LA FABRICACIÓN DE BIOSENSORES 2.1 Introducción 2.2 Tecnología Screen Printing 2.4 Aplicaciones 2.6 Conclusiones 5. TECNICAS DE FABRICACIÓN Y MINIATURIZACIÓN 5.1 Microelectrodos 5.2 Microelectrodo Modificados con Enzimas. 5.3 Arreglos Miniaturizados 5.4 Agujas de Semiconductor 5.5 Membranas y Encapsulamiento BIBLIOGRAFIA

Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores ANTECEDENTES Los electrodos convencionales de Enzimas usan dispositivos voluminosos como transductores, tales como los electrodos de oxigeno o hidrogeno. Los sensores de Electrodos o membranas de enzimas son muy caros y necesitan mantenimiento regular. Por tanto, se necesita un Tipo de sensor mas confiable y amigable en el mercado. Esto se realizo con la invención de Electrodo de Enzima Mediado y la introducción de la tecnología Screen Printing. La tecnología de Electrodo de Enzima Mediado se demostró en La tecnología Screen-Printing se utiliza en la industria de la electrónica y la de impresión. En 1982 esta tecnología formo parte de los procesos de producción de biosensores. Todos los sensores se hicieron de electrodo de enzima y screen-Printed. Un claro ejemplo es un sensor pen-size de glucosa que utilizo ferrocence mediado enzimático electroquimico y tecnología screen-printing, dando una lectura de glucosa en forma digital en 30 s. Se considero el principio de una nueva generación de biosensores, comercialmente viable.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Tecnología Screen-Printing Materiales y Métodos 2.1.1 Matriz de Sustrato. La matriz de sustrato es el material que provee la superficie para la Impresión de la parte funcional y constructora del sensor. El costo del sustrato debe ser de Consideración. Algunos materiales se pueden explotar para este propósito estos son: PVC, es el mas comúnmente utilizado por propiedades dielectricas, estabilidad, bajo costo y trabajabilidad. Ceramica (Al2O3) alta resistencia, Fuerza, dureza. Policarbonato. Nitrocelulosa. Fibra de Vidrio.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores 2.1.2 Inks. Las tintas o pastas son depositadas secuencialmente a través de “mascaras” en el sustrato de forma estructural y funcional en las partes del sensor. Un amplio rango de pastas con diferentes propiedades químicas (viscosidad, conductividad, resistencia termal, resistencia al agua) pueden diversificar los requerimientos en la fabricación de Biosensores. Se pueden clasificar en dos categorías: Pastas Conductivas (materiales conductivos, agentes de atadura o resinas, solventes y aditivos). Pastas Dieléctricas (Polímeros o Cerámicas). Las pastas de carbon son muy utilizadas sobre todo en electro análisis, tienen muy bajo costo.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Ink Producto Comercial o Composición Aplicación Inmovilización Referencia o Proveedor Conductivo Pasta de Carbon 70% polvo de grafito y 30% parafina, o 60% Electrodos de Trabajo Aire seco o curación termal 34 polvo de grafito y 40% aceite mineral. 1-4% si la enzima y el mediador mediador tal como ferrocence (oxidasa) o no son incorporados. Azul de Meldona puede ser reducido o incrementado trabajando potenciales 70% polvo de grafito y 30% parafina o 60% grafito Rellenando para track y 40% aceite mineral. conductivo Carbon/grafito ink SS o Electrodag Electrodo de Trabajo y 71 oC, 2-5min Asheson pad conductivo Pasta de Ag Pastas de Plata, Series Electrodag track conductivo Pasta Ag-Pd No 7474 o QM 22 Electrodo de Referencia 850 oC, 30min. Al2O3 DuPont Bag y track conductivo Homburg, Germany Pasta Ag/AgCl Plata/Plata pastas chloride, SS y PE series Electrodo de Referenia C. 2-5 min Acheson 0.2 g AgCl con 1g Ag ink Aire Seco

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Ink Producto Comercial o Composición Aplicación Inmovilización Referencia o Proveedor Dielectrico Pasta PVC PVC ink, SS series Capa de aislamiento Aire Seco Zhongvi Inks Pastas Ceramicas Fodel 6050 pasta dielectrica 80oC, min exposición DuPont compatible con Au UV por 1-3 seg. Comptible con 96% sustrato de Ceramica de Aluminio y conductor Au. Encapsulados HEC 3-4% (w/v) celulosa hydroxyetil agregada con Membrana de dyalisis 35 triton 100 (0.01%) y polietileno glicol (3%) externa CA 2% (w/v) acetato de celulosa Gafquat 4% cationes de Gafquat. Gafquat 75N Membrana de enzima 36 (Internations Specialty Producs Ltd). estable

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores 2.1.3 Elemento de Sensado. Cualquier enzima puede utilizarse como elemento de sensado, pero algunas de estas son muy caras de obtener y muchas tienen muy poca estabilidad termal y el biosensor tiene que ser constantemente calibrado. En la actividad enzimatica se puede generar error. Tienen un corto tiempo de vida. Oxidasas y dehidrogenasas son las mas comúnmente usadas. Propiedades electromecánicas de muchas de estas enzimas pueden ser caracterizados con electrodos como el ferrocence, benzoquinones y dyes actives. Algunos elementos biológicos pueden ser utilizados como elementos de sensado, tales como los anticuerpos y células microbianas. El elemento de sensado es inmovilizado a los electrodos a través de enlace covalente, cruza ligada, o absorción. La inmovilización puede mejorarse por técnicas de entinte (pasta) o Screen-Printing. La pasta debe de ser cuidadosamente aplicada asegurando que el elemento sensor se disperse adecuadamente, si no, un error puede ocurrir. Un inconveniente del método de impresión es que la gran cantidad de pasta de enzima debe ser aplicada a tiempo, la cual no es económico a escala de laboratorio.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Aparato Las maquinas de Screen-Printing pueden ser horizontales, verticales o montado en escritorios. La superficie de impresión puede ser plana, rotatoria o cilíndrica y el proceso de impresión puede ser directo e indirecto. Para la fabricación de Biosensores el método mas conveniente es el método plano y maquina de impresión directa. En la figura 1 se muestran las principales partes de la maquina Screen-Printing, la escoba es movida por un elemento neumático y la velocidad de impresión es controlada por un regulador de frecuencia. Fig. 1 Proceso Screen printing, la presión es Generada por un compresor. En la impresión de chorro de tinta, el liquido abastecedor que entrega el elemento de sensado a cada tira del sensor opera en volúmenes controlados. En la figura 2 se puede mostrar el proceso de BioJet Quanti 3000TM (BioDot Inc.)

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Aparato Fig 2. Diagrama de proceso Screen Printing para preparar biosensores. Imprimiendo Patrones El sensor puede ser tres electrodos (electrodo de trabajo, electrodo contador y electrodo de referencia) o una configuración de dos electrodos (sin electrodo contador). Experimentos convencionales de voltametria ciclica, incorporan un sistema de tres electrodos mejorando el flujo de corriente a través del electrodo de referencia.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Imprimiendo Patrones Si se toma en cuenta una medición múltiple, el sensor se debe de diseñar como un electrodo patrón, multitrabajo. Un grupo de mascaras se hace con técnicas de fotolitografia. Cada mascara contiene un patron. Nylon, Poliéster, stainless y mallas de metal son los materiales de las mascaras. La malla se reviste con gel fotosensitivo con un master plate. El revestimiento del área del plate se solidifica, dejando revestida el área aglutinada. El resto es removido por un solvente. Después se lava y se seca Se le da mantenimiento a la mascara.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Proceso de Impresión En la figura 3, se muestra un diagrama del proceso de impresión tomando como ejemplo un sensor de glucosa en configuración de doble electrodo. Los detalles son mostrados en el protocolo 1. Fig 3. Tubo de entinte con electrodos screen printed. El tubo inyecta la solución mediadora de enzima en cada electrodo de trabajo. La boca se fija en la posición mientras la plataforma mueve de derecha a la izquierda las screen printed tarjetas de electrodo, manejado por un motor pasos de alta resolución, asegurando el tamaño con precisión controlada del volumen de la solución de mediador de enzima para ser depositado en la posición correcta de cada superficie de electrodo.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores PROTOCOLO 1 Preparación de un por Screen Printed electrodo de glucosa Un modelo S-600M screen Ptinted es utilizado para imprimir a través del electrodo. Todo proceso del secado se emprende en la temperatura ambiente. Limpiar el sustrato PVC (150 mm x 150 mm x 0.5 mm) con agua, etanol anhidro, y agua destilada secuencialmente. Cada hoja del sustrato permite imprimir un grupo de 45 sensores. Fija el sustrato de PVC limpio en la tabla de impresión de la maquina de impresión por presión atmosférica negativa. Coloca la primer mascara, la cual es diseñada para imprimir las tiras conductivas, sobre el sustrato en la mesa contra los registros de stop, asegurando queden los patrones exactos. Vierta la tinta de plata en la pantalla. Esparza la tinta sobre la superficie de la pantalla con el enjugador para que la tinta sea hecha para aceptar la máscara. Dejar el solvente tinta evaporarse a temperatura ambiente. Imprimir el Pad de carbón en las tiras de plata por el mismo procedimiento de impresión con la segunda mascara. Permitir que la tinta se seque. El pad de carbón protege la tira de plata por oxidación a través de la exposición con el aire.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Imprimir el electrodo de referencia con la tercer mascara, aplicando una mezcla de tinta de plata con finely ground silver chloride en radio de 2 g de Ag Cl por gramo de tinta, en el final del pad de grafito. La tinta se deja otra vez secar en un cuarto de temperatura. Imprimir la etapa de aislamiento, con la cuarta mascara aplicando una tinta PVC, dejando las terminales y la superficie expuestas. La superficie activa es un área circular forma un planar, electromecánica célula de dos electrodos. Un semicírculo es el electrodo de carbón y otro es el electrodo de referencia plata/plata chloride. Preparar una solución de ferrocencedimetanol 1.1 en agua destilada. Disolver Aspergillus Níger oxidasa de glucosa en solución ferrocence, haciendo la concentración, haciendo la solución final a 10 unidades GOD/ml Vierte 1-2 ml de solución en cada superficie de electrodos de carbón por uso de liquido dispensario BioDot . Los electrodos entonces permiten secar en un desecador a temperatura ambiente. Imprimir el exterior de la membrana (HEC) en la superficie de la célula del electrodo cubrir la enzima y la capa de ferrocence. La solución HEC es preparada por la mezcla 3.5% (w/v) hydroxyethyl celulosa, 0.02% Triton X100, y 3% glicol de polietileno en agua destilada. Después del agua, tiene que evaporar bajo condiciones ambientales, el sensor puede almacenar sobre gel de sílice 4oC.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Aplicaciones Debido a que son confiables, baratos y rápidos, los biosensores Screen-Printing han sido reconocidos como la técnica de uso mas practico. En los últimos 10 años, biosensores Screen_printed han sido aplicados en varios ambientes tales como: Diagnostico Clinico. La importancia en el diagnostico clínico de los biosensores se ha demostrado en los medidores de glucosa de bolsillo que hay en el mercado en muchos estilos. Con este dispositivo millones de diabéticos pueden en casa ver los niveles de azúcar en la sangre. Un ejemplo de esto es un sensor selectivo de glucosa hecho a base de Hexacianoferrita y GOD con pasta de carbón Con screen –Printing se puede medir lo que es el acido urico, urea y queratina, colesterol, lactosa y creatina.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Aplicaciones Monitoreo de Medio ambiente. Screen-Printing ofrece la facilidad de poder detectar tóxicos y contaminantes. Ejemplo seria el efecto de pesticidas químicos en la salud humana, ya que se han construido sensores para detectar importantes pesticidas. Se pueden utilizar para medir los niveles de nitrogeno y evitar la eutrophicatión. Alimentación y Bioprocesos. Se vio anteriormente la contribución de la medición de glucosa con Screen-Printing, también se usa en control de bioprocesos y calidad en alimentos. Seguridad y Defensa.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Analyte Elemento Sensor Configuración del Eletrcodo Performance Referencia Lactosa en Leche b-galactosidase Pt electrodo de trabajo 2-25 mmol/I SD: 8.81% 65 Oxidase glucosa Ag/Pd electrodo de referencia (n=16) estabilidad, mas de tres meses. Acido Lactico Dehidrogenase Lactate NAD (+) Meldona Azul modificada electrodo 1-20 mmol/l 34 de trabajo de carbon y Ag/AgCl CV=8.7% (n=6) combinado contraelectrodo/ref Alcohol en brevage Alcohol dehidrogenase NAD (+) 35 mmol/1 90% 15 actividad residual después de 40 dias. NADH y lactosa NAD (+) y lactate dehydrogenase , NAD 3-60 mmol/l lactate 16 0-20 mmol/1 Acido Urico y Xantina Oxidase Electrodo de trabajo de carbon 1-50nmol/1 CV: 2% 62 Hypoxanthine fish freshness Maltosa y Glucosa Amyloglucosidase/glucose oxidase Electrodos de trabajo de carbon Maltosa, -20 mmol/l 35 (A/G) Ag/AgCl electrodo de referencia Glucosa, -40mmol/l CV: %

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Analyte Elemento Sensor Configuración del Eletrcodo Performance Referencia Almidon de glucosa GOD glucoamylasa Electrodo de trabajo de carbon Starch, 0.4% (w/v) 48 Ag/AgCl electrodo Glucosa, -20 mmol/l Lysina en fermentación Oxidas lysina incitado en hidrogel Electrodo de trabajo de platino 66 de poliuretano Ag/AgCl electrodo de pseudoreferencia, contraelectrodo de carbon Gentamicina en leche anticuerpo de Anti-gentamicina Cflujo en celulas electromecanicas 0-10 ng/kg CV: = 132%

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Otros Enfoques Los sensores de DNA han tenido un notable progreso en el campo de los Biosensores. Se ha desarrollado sensores electromecánicos de secuencias de ADN. Con base al rastreo de oligonuleotidos funcionan algunos sensores con electrodos de grafito screen printing. Biomimetica o impresión molecular ha sido reconocida como una técnica versátil para la preparación de ciertos polímetros. En 1990 se propuso un método de preparación por medio de un biosensor biomimetico.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Screen-Printing Métodos para la Producción de Biosensores Conclusiones La tecnología Screen-printing ha mostrado una gran utilidad en la investigación de Biosensores. En los últimos 10 se convirtió en una tecnología de gran utilidad. El diseño de Biosensores puede ser mas flexible, disponible o reutilizable, simple o múltiple propósito, superficie de sensado plana o esférica, proceso de electrodos intermedio o directo. Los desarrollos exitosos del sensor dependen en gran parte del costo y la estabilidad de los elementos que presienten. Esto es un problema intrínseco de la naturaleza biológica. Muchos vectores genéticos de la expresión se han desarrollado para la expresión de alto nivel de enzimas o de otras proteínas que son una herramienta poderosa para el mejoramiento de la enzima hacia las propiedades deseadas.

Técnicas de fabricación y Miniaturización
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Antecedentes Hay ventajas y desventajas en la miniaturización de transductores que son utilizados como Biosensores. Si los biosensores son destinados para mediciones de tejidos vivos, estos deben de ser suficientemente pequeño para minimizar el daño en la célula o la micro circulación en el tejido, y además no debe obstruir el flujo en la sangre Los dispositivos pequeños suelen ser menos duraderos y mas fáciles de romper que los mas grandes, las señales que generan son mas difíciles de detectar. Transductores miniaturizados, tienen un tiempo de respuesta mucho mas rápido que los transductores grandes.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.1 Microelectrodos 5.1.1 Micropepitas de Vidrio. Hay una amplia variedad de micropepitas hechas de vidrio pulled Utilizados para medidas espaciales muy detalladas. Varias modificaciones crean muchos tipos de microelectrodos. Algunas aplicaciones de estos son para medir potenciales y acciones potenciales en membranas intracelulares a través de micropipetas llenas de sal fisiológica. En 1986 se utilizo por primera vez estos micorelectrodos. En 1986 Browm y Flaming describieron las técnicas de fabricación de estas micropepitas en dimensiones debajo de micras.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.1.2 Bicelado Micropepitas de Vidrio son biseladas por dos razones: 1.la punta hacerla mas aguda para insertarla en el tejido o las células. 2.El incremento en el área de apertura baja la resistencia eléctrica de la punta o reduce la resistencia hidráulica para las pepitas utilizando fluidos microinyectados. Los tamaños de la punta de microelectrodos de saline_filled para el potencial de membrana de célula o medidas neuroficsiologicas pueden ser controlados con cuidado controlando su resistencia eléctrica. Cuando los diámetros de las micropepitas son de alrededor de 0.1 μm, la resistencia es de 150 MW, cayendo alrededor de 20 MW cuando la talla se incrementa a 0.5 μm. hay otras técnicas donde se muelen girando superficies sólidas.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.1.3 Mediciones de Punta El limite de la resolución de un microscopio es de 0.4mm, no se puede medir adecuadamente. Una técnica es utilizar una micrografia de electrón rastreador, aunque no funciona con microelectrodos de vidrio. Y se genera mucha incertidumbre en algunas mediciones. Por medio del método de conteo de burbujas se midió el diámetro de algunas puntas. Se encontro la siguiente relación, la dimension de la punta esta dada por: D=Interior de la punta. P=Presion dada en Pascales

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.1.4 Microelectrodos de pH de Barril sencillo. Electrodos de vidrio han sido miniaturizados utilizando diversos diseños de microelectrodos como se ilustra en la figura 5.1. En 1956, Cadwell fabrico electrodos de vidrio de 50 a 80 μm de diámetro y midió el pH intracelular en fibras musculares de cangrejos grandes y calamares. Un pequeño electrodo de pH fue construido en 1967, el cual se muestra en figura 5.1a tiene una punta abierta con longitud de150 μm. En 1964 se hizo un microelectrodo de pH que se ve en la figura 5.1b, el cual ofrece mejoras significativas, el cual permite tener una resolución para mediciones de pH intracelular. Fig Esquemático de los diferentes tipos de microelectrodos de vidrio sensitivo desarrollados por: a). Hinke (1967) b). Thomas (1974) c). Dehemptinne (1980) d). Javaheri at al. (1985)

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.1.5 Microelectrodos de pH de Doble Barril. En 1980 se modifico los electrodos de pH de vidrio utilizando doble Barril. Un diseño se muestra en la figura 5.1c. El diseño es una combinación del punta recessed Thomas tipo vidrio pH con un segundo barril. Se puede colocar intracelularmente. En 1985 se describe otro diseño, el cual se muestra en la figura 5.1d. Los métodos de construcción son mas complejos. Un pequeño bulbo de pH sensitivo se realizo como se muestra en figura 5.1d. La micropepita de doble barril se coloca en vidrio de Borosilicato. Un barril es utilizado de referencia y otro de aislador. Una segunda micropepita fue colocada y la punta fue fundida con microforge. La micropepita de vidrio se inserta dentro del barril de borosilicato de vidrio. Las dos puntas se funden juntas por calor local con el microforge mientras se aplica presión dentro de la micropipeta de vidrio.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.1.6 Microelectrodo Ion-Sensitivo. Detalles de fabricación de microelectrodos ion-Sensitivos utilizan liquido neutral cargado de ionoferas en micropepitas de vidrio. Otro tipo de microelectrodo Ion-Sensitivo utiliza resinas de cambios iónicos, la cual suele tener una alta resistencia eléctrica comparada con el mas reciente portador de ionophores. Las micropepitas primero son biseladas, luego, la punta de vidrio se trata de reducir causando una alta densidad de grupos hydroxyl en la superficie del vidrio. Esto puede ser acompañado por salinización. Este paso de salinización, produce un enlace covalente en la superficie de vidrio, la cual crea una interface mas estable dentro de la punta para retener el liquido portador. Este liquido se introduce por succión o por alta presión. El microelectrodo debe de ser almacenada en la misma solución. El tiempo de vida es limitado. Un nuevo tipo en microhueco se diseño para transductores iónicos en 1992 por Abatí y Moriizumi. Se combina la construcción de micropepitas de vidrio con método de fotolitografia.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.1.7 Mediciones de Ion y pH. Todas las micrpepitas de vidrio y microelectrodos Ion-Sesitivos, tienen alta resistencia eléctrica. Requiriendo una alta impedancia de entrada para los amplificadores que miden su EMF. Una desventaja de los electrodos de vidrio de pH es el tiempo de respuesta comparado con los sensores de pH. Micropepitas de Vidrio son muy frágiles, y las mediciones no se pueden hacer en condiciones fisiológicas donde hay mucho movimiento. Las paredes de los transductores diseñados por Abatí y Moriizumi en 1992, tienen una baja resistencia y una baja unión de potencial, son de capacitancia mas estable que los convencionales micropepitas de vidrio. 5.1.8 Micropepitas de Metal. Las miropepitas de metal mostradas en la figura 5.2a, son mucho mas durables que las micropepitas de vidrio. En 1960, aparece la primera técnica de etching para producir microelectrodos con puntos muy finos, mas pequeños que 0.1 μm. Otros han usado un proceso mecánico de dipping en combinación con electrolisis para producir mas finos microelectrodos de metal. En 1960 Wolbarst uso en mediciones electrofisiológicas, técnicas de etching idénticos para fabricar microelectrodos tipo aguja.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Fig Esquemático de los diferentes tipos de microelectrodos de O2 desarrollados por: a). Wolbarsht et al. (1960) b). Whalen et al. (1967) c). Tsacopoulus y Kehumenkuhler (1977) d). Whalen et. Al (1973) 5.1.9 Aislamiento. Después de limpiar el agua destilada y secar completamente, El microelectrodo de metal grabado fue revestido excepto en la punta como se ve en la figura 5.2a con el vidrio calentado con un punto de fusión en microforge. La punta se empujó en la gota fundida de vidrio, entonces la flecha avanza con el. Para hacer el vidrio mas trabajable, es necesario incrementar el calentamiento eléctrico del vidrio. A veces es necesario fracturar un poco una capa delgada de vidrio para que pueda pasar corriente por la punta. Parylane es un buen aislante. Un vidrio aislante es el antimonio, el cual fue utilizado en 1968 por Vieira.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Nanodos. En 1990, se modifico la técnica para micropepitas Pt de puntas descubiertas vidrio recubierto para producir resolución espacial a escala de namometros. Estas pequeñas dimensiones de estos ultramicroelectrodos, los cuales se les llama nanodos, fueron validados por un microscopio de rastreo de electrones con magnificación de La técnica de fabricación es de alambrar por etching y revestimiento de vidrio. El vidrio revestido es calentado entre 1250oC y 1370oC, luego se mueve el cable de metal etched con a una velocidad constante en el vidrio fundido. El 10% de los nanodos exhiben sensitividad electromecanica en radios de rango de 10 a 100 A. Corrientes medidas son muy pequeñas, aunque hay densidades de corriente buenas, del alrededor de 70 A/cm2. Se pueden medir mejor las rápidas transferencias con los nanodos. Microelectrodos de aleación de metal recessed. El microelectrodo cátodo interrumpido de PO2 fabricados en 1967 por Whalen, combinan las micropepitas de vidrio y electrodos de metal, y producen microelectrodos con gran flexibilidad mecánica que los metales cableados de grabado de vidrio recubierto. Un esquemático se del diseño de microelectrodo interrumpido se muestra en la figura 5.2b. Después de empujar fuera una micropepita de vidrio, y biselar la punta, esta se rellena con una aleación de metal fundido (antimonio, bismuto o estaño). Algunos metales permiten ser reávidos de la punta para formar una interrupción de 20 a 50 μm de profundidad.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI La punta se sumergen en solución de Platino asta llenar la interrupción, luego se sumerge en agua destilada. Se puede introducir una membrana hidroponica en la interrupción, y luego se deja secar. Microelectrodos secos pueden ser almacenados indefinidamente, pero a la membrana se le debe dejar rehidratarse en agua salina o destilada. Las dimensiones son tipicamente < 2μm. Las corrientes en la interrupción son de amp para microelectrdos de CO2. Microelectrodos de Doble Barril. Un microelectrodo de doble barril fue diseñado en 1977, con un grabado de Pt sellado cableado con cera en el barril, se muestra en figura 5.2c. El segundo barril fue llenado con sal fisiológica. Ejemplo para mediciones de PO2 y actividad bioeléctrica en el cerebro y en la retina de las abejas utilizando los microelectrodos descritos. La aleación de metal Whalen-Nair llenado, microelectrodo de cátodo interrumpido de PO2 han sido fabricados en configuración de doble barrido, como se muestra en figura 5.2d. En 1987 se utilizaron los microelectrodos de doble barril de PO2 y los potenciales electrofisiológicos en el ojo del gato. En este electrodo en un barril le coloca un cable hecho por un metal fundido en un tubo de teflón. Combinando los diámetros de la punta, se pueden hacer de menos de 5μm.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Microelectrodos de Fibra de Carbon. Recientemente, fibras de carbón (7 o 12 μm de diámetro) han sido utilizadas para construir microelectrodos para medir neurotransmisores y sus metabolismo in vivo. La fibra de carbón es colocada en una micropepita de vidrio, reparando la fibra en la punta por lacre en la parte baja del tallo con epoxy u otra sustancia adhesiva conveniente. El contacto eléctrico con la fibra de carbón se hace por llenar la parte trasera de la parte superior del cuerpo de electrodo con mercurio, con pasta de carbón, o con una solución de electrolito En la parte alta del cuerpo del electrodo con mercurio, pasta de carbón o solución electrolítica. Pintura de plata conductiva (Ag/AgCl), es otra técnica común para realizar la conexión eléctrica en la fibra de carbón. Se pueden utilizar para detectar neurotransmisores, alta reactividad en la oxidación Superficies de carbón modificadas químicamente. En 1987 Coury reviso los métodos para modificar químicamente la superficie en microelectrodos de fibras de carbón. Métodos electromecánicos han sido utilizados para deliberar cambios en la composición de los óxidos de carbón en la superficie del electrodo. Electrodos que han sido pretratados por alternancia entre voltaje periódico y directo realzan su sensitividad a la dopamina. En 1989, se utilizo Nafion un polímetro de DuPont para recubrir los miroelectrodos de fibra de carbon. Nafion crea una membrana que tiene una gran diferencia de permeabilidad entre las carga oinicas. Investigadores han reportado que pretratar electromecánicamente o revestir los electrodos con Nafion han tenido reducción en la sensitividad después de haber sido utilizados para estudios del cerebro.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Superficies de carbón modificadas por calor y electricidad. Una técnica común para mejorar los microelectrodos de fibras de carbón es pasar una corriente a través de la punta. En 1992, se describieron diferencias en mejoras electromecánicas de fibras de carbón después de tratamiento de calor en vació y eléctrico. Se tomo 3000 fibras individuales se les dio tratamiento de calor y luego, y se les paso una corriente de 3000 mA en un buffer de fosfato. Con esto se generaron fracturas y se incremento la capacitancia en Después con pruebas de dopamina se vieron mejoras. En 1992 se encontró que las superficies de carbón pueden endurecer al remover el anódico producido por las superficies fracturadas. El tratamiento de calor en vació, puede ser utilizado para remover irregularidades en la superficie de las fibras de carbón. Superficies de carbón modificadas por Láser. En 1991, se encontró que los microelectrodos de fibras de carbón mejoraron propiedades de transferencia de carga después de pulsar la punta con un láser de nitrógeno. La energía del láser vaporizado y oxido la superficie y se puede exponer en sitios mas reactivos. Los microelectrodos de fibra de carbón se trataron de la misma manera para reducir la dopamina en potenciales bajos, y el inverso del cíclico busca la onda que se encontró para ser menos dependiente en el PH.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Requerimientos de Medición. Electrometros de alta impedancia y circuitos de protección son necesarios. Capacitores de retroalimentación positiva pueden ser utilizados para reducción de capacitancia en algunos tipos de microelectrodos. Muchas propiedades eléctricas cambian en el microelectrodo si se le coloca a gran profundidad de un liquido. Otros problemas son el ruido electromagnético y la vibración. Protección Eléctrica. Técnicas para el mejoramiento de la protección eléctrica incluyen los alrededores físicos del microelecrodo de referencia. Microelectrodos han sido recubierto con pintura de plata, o deposición de vapor de metal. En 1982 se descubrió dos técnicas para protección de micropepitas de vidrio. Uno fue cubrir un microelectrodo con plata y aislarlo con un polimero, generando una alta carga capacitancia entre el microelectrodo y la protección. Otro diseño fue un microelectrodo doble concéntrico con el microelectrodo central revestido del externo. El externo revestido por polystirol para sellar, los dos se colocan juntos y las puntas se aíslan. Esto redujo la carga capacitiva

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Mediciones clínicas con Microelectrodos. Hay algunas aplicaciones clínicas limitadas utilizando microelectrodos de metal grabado para mediciones de PO2 en tejidos humanos. En 1990 se realizaron mediciones de PO2 para tejidos musculares. En 1989, se utilizo un electrodo de polarografia de O2 durante la cirugía midiendo la tensión acuosa del humor O2 en el ojo humano. En 1977 se midió el PO2 del tejido cerebral a una profundidad de 2 mm en la corteza humana. 5.2 Microelectrodos modificados con Enzimas A sido pequeña la investigación en el desarrollo de biosensores modificados de enzimas con dimensiones de microelectrodos verdaderos. En 1980 se describió brevemente un microbiosensor de glucosa de un microelectrodo construida de platino-iridio grabado con una punta de 1 μm.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.2.1 Co-Deposito de Oxiadasa de Glucosa y Rhodio. En 1992 se co-deposito rodio y oxidasa de glucosa en microelectrodos de fibra de carbón en un simple paso. Rhodio fue agregado en una solución que contiene una solución oxiadasa de glucosa. El resultado del material electro depositado en la superficie fue observado bajo un microscopio de escaneo de electrones y se encontró mucha aspereza. No es recomendado para insertarlo en tejidos. 5.2.2 Microbiosensores de Glucosa recessed. Un diseño de microbiosensor de glucosa y fibra de carbón recessed, ha sido diseñado en Algunos microbiosensores fueron también tratados con glutaraldeidos y acido ascorbate. El racional para este tratamiento fue por miniaturización posible de interferencia de ascorbarte desde la siguiente reacción: Oxiadasa Ascorbate 2l-Ascorbate + O dehydroascorbico + 2H2O Los microbiosensores de glucosa tienen una perdida de sensitividad inicial de 20% en la primer hora, luego se estabilizan. El 90% del tiempo de respuesta de estos microbiosensores es menor a 1.5 seg.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.2.3 Microbiosensores de Acetilcolina. Microbiosensores para detectar acetilcolina fueron fabricados en 1991, por introducir 125 U esterase y 125 U de oxidase choline en un grabado de fibra de carbón interrumpido y combinando la enzima con glutaraldeido. La catalización de las enzimas forma las siguientes reacciones: Esterase de acetilcolina Acetilcolina + H2O acetato + choline Choline oxidase Choline + O aldeido betain + H2O2 Betain aldeido + H2O betain + H2O2, en presencia de O2 Los microelectrodos fueron tratados con sal orgánica. El 90 % del tiempo de respuesta para este microbiosensor fue menor a 4 segundos. Los microbiosensores de acetilcolina son sesitivos al ascorbate, los cuales causan interferencias significativas para mediciones en tejidos donde hay bajos niveles de acetilcolina.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Arreglos Miniaturizados Muchas de las ventajas para microelectrodos pueden ser logradas con arreglos miniaturizados, la desventaja es que se necesita amplificar las corrientes pequeñas cuando se hacen las mediciones amperometricas. El efecto beneficial de miniaturizar un transductor electromecanico por formación de un arreglo de microelectrodos como se ilustra en la figura 5.3 5.3 Con múltiples cátodos hay menor disturbio del campo de concentración en un transductor electromecánico comparado con un cátodo simple con la misma área total.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.3.1 Electrodos de O2. Kessler y Grunwald en 1969, desarrollaron un electrodo de O2 de superficie multialambrada que fue subsecuentemente utilizada en numerosos experimentos de animales. El cátodo descubierto y el diseño de la membrana recubierta se utilizaron. Las corrientes individuales en los cátodos, fueron monitoreadas. Los histogramas de distribución de frecuencias se generaron por mediciones de PO2 en tejidos. En 1978, se utilizo un multiarreglo similar de electrodo de superficie de PO2 para medir el PO2 del tejido renal en pacientes con enfermedades en los riñones. En 1980 se desarrollo un multiarreglo de electrodo de O2 con 10 a 20 vidrios revestidos con cables de oro de 5 a 10 μm sellados con epoxy en una aguja que puede ser insertada en tejido. En 1984 con agujas similares, se midió el PO2 de los músculos en voluntarios saludables y pacientes críticos, y se demostró que las infusiones de dopamina puede incrementar el PO2 en tejidos. 5.3.2 Arreglos de electrodos de O2 transparentes. Sargent y Gough diseñaron 1991 se diseño un arreglo de electrodo de O2 transparente que consiste en ocho electrodos de trabajo de Pt con diámetros de alrededor de 100 μm y espaciados 200 μm, aparte con una gran electrodo de referencia común de Ag/AgCl y un gran contraelectrodo de Platino. Todos los electrodos fueron hechos con semiconductores por métodos de fotolitografia. Vidrio fue utilizado para soportar la estructura, una delgada capa de polymida recubre el vidrio y es curado con rayos UV a alta temperatura, entonces el platino farfullea de manera uniforme, aprox. 370 Amstrong de un metal delgado. Los tranductores electromecanicos, pads y conexiones eléctricas se realizaron por métodos de fotorresistencias.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.3.3 Arreglos de Bandas. Samuelson en 1991 describió un método de Fotolitografia y un método ion beam etched para fabricar un microarreglo con bandas de ultramicroelectrodos. Utilizan técnicas de patrones de fotorresistencias para producir bandas de oro de 1 μm de ancho y 200 nm de grueso 5.3.4 Arreglos de Microhuecos. Un arreglo de microhuecos de fibras de carbón interrumpido en epoxy ha sido fabricado y probado en 1989, el cual se muestra en la figura 5.4. 5.4 Arreglo de microhuecos hecho de epoxy-carbon con recessed catodos de fibra de carbon platinizadas para mediciones O2, diseñados por Morita y Shimuzu (1989).

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.3.5 Arreglos de Microporos. Otro tipo de microarreglo se diseño en 1989, que consistió en llenar de poros membranas de películas de policarbonato con pasta de carbón. La talla de los poros para diferentes membranas fueron nominalmente reportadas de 12, 8 y 3 μm por Nucleopore Corp. Con el Microscopio de electrones se confirmo el diámetro del poro, y determino que la densidad del poro fue 6.4 x 104, 8.8 x 104, y 1.36 x 105 poros/cm2, por cada grado de la membrana. Agujas Semiconductoras Ottosensors Corporation hizo una aguja tipo sonda utilizando una película delgada y técnicas de fabricación de estado sólido que puede tener múltiples transductores, similares a los que se muestra en la figura 5.5. Estas agujas son comercialmente disponibles con transductores para temperatura, biopotencial y mediciones de O2. Las señales son amplificadas por medio componentes electrónicos y las sondas se pueden hacer mediciones en tejido cerebral. Grabaciones de biopotenciales se pueden hacer por electrodos de Ag/AgCl con áreas pequeñas (10 x 10) μm o grandes (50 x50) μm.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.5 Esquemático de la punta de un lente probado con múltiples sensores fabricados por Fotolitografia. Señales para cada sensor pueden ser amplificados con chips electrónicos fabricados en el dispositivo, o procesado después a través de conexiones asta el fin.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.5 Biosensores ENFET Técnicas de fotoliografia han sido desarrolladas para fabricar Transistores de Efecto de Campo Ion Sensitivos (ISFET) y Metal Oxido Semiconductor (MOSFET). Estos pueden ser modificados para ser utilizados como Biosensores basados en enzimas (ENFET) 5.5.1 ISFET. Para las membranas Ion Sensitivas son colocadas sobre el gate y el voltaje se aplica a través un Ag/AgCl o SCE de referencia en la solución muestra. Como la concentración Ionica varia, el campo eléctrico en el gate modula la conductancia del semiconductor. El CO2 puede ser sensado por ISFET utilizando cambios en el pH. 5.5.2 MOSFET. El gate puede ser fabricado con superficie de Metal Oxido como Pt o Pd, el cual sirve como catalizador por diferentes reacciones. Gases y vapores químicos que pueden ser detectados por el transductor.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI 5.5.3 ENFET. Cada tipo de semiconductor FET puede ser modificado colocando enzimas sobre el transductor. Un esquemático se muestra en la figura 5.6 donde se utiliza para medir urea utilizando el pH hecho en Se deposito una delgada capa de SiO2 en sustrato de zafiro y Fosforo implantado en la fuente, el drene y una pequeña cantidad en el gate. La sensitividad al pH se mejoro por revestimiento a 1000 μm de Si3N4 en los dos FETs. Fig. 5.6 Dibujo esquemático de un biosensor diferencial tipo FET producido por fotolitografia el cual utiliza membranas modificadas por enzimas.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI Membranas y Encapsulación Es imperativo que el dispositivo semiconductor y los cables conectados sean inmersos en muestras acuosas y que retengan su aislamiento eléctrico de la muestra. Entre 1989 y 1991, se Eligio zafiro para enlazar el sustrato y se reporto una excelente resistencia en la infiltración de agua, permitiendo retener aislamiento eléctrico en muestras húmedas por largos periodos. Nuevas técnicas para atrapar proteinas, anticuerpos y nuevas combinaciones de enzimas son desarrolladas en diferentes labs. Fig. 5.7 Dos métodos para aplicar membranas delgadas en biosensores. Para el método spincoating, una bruma fino se rocía como el dispositivo que gira en 1000 a 2000 rpm. Con un chorro de tinta, los métodos de la automatización se pueden utilizar para aplicar un volumen pequeño en una ubicación específica

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REFERENCIAS [1] Biosensors. Theory and Applications Donald G. Buerk [2] Biosensores Jon Cooper and Tony Cass [3]Tratado de Fisiologia Medica Guyton Arthur

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