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OCH 3 OH COOH Acido vainíllico OCH 3 OH Ácido ferúlico Acido verátrico H 3 CO Acido siríngico COOH OCH 3 COOH OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 OH CH2CH2 Eugenol.

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1 OCH 3 OH COOH Acido vainíllico OCH 3 OH Ácido ferúlico Acido verátrico H 3 CO Acido siríngico COOH OCH 3 COOH OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 OH CH2CH2 Eugenol CHCHCH2CH2 OCH 3 OH CHO Vainíllina OCH 3 OH Guaiacol

2 Ruptura del anillo aromático OH COOH Ruptura intradiólica u orto OH CHO COOH Ruptura extradiólica o meta OH

3 Carboxymuconato Protocatecuato OH -O2C-O2C Catecol CO 2 Muconato -O2C-O2C CO 2 C=O O -Carboxymuconolactona Muconolactona CO 2 O Ketoadipato O CSCoA CO 2 O Ketoadipil-CoA Succinil-CoA+Acetil-CoA pcaHG protocatecuato dioxigenasa pcaB carboxy-cis,cis muconato lactonizante pcaC carboxymuconato decarboxilasa catC muconato isomerasa catB cis,cis muconato lactonizante pcaD, catD Ketoadipato-enol-lactona hidrolasa C=O CO 2 Ketoadipato-enol-lactona O pcaIJ, catIJ Ketoadipato-succinil-CoA transferasa pcaF, catF Ketoadipil-CoA tiolasa catA catecol 1,2-dioxigenasa -O2C-O2C CO 2 C=O O pcaIJFBDKCHG pcaU quiBCXA pobSRpobA

4 OCH 3 CHCH O CHCHCH2CH2 OH CH2CH2 Eugenol CHCHCH2CH2 OCH 3 OH CH2CH2 CHCH CH 2 OH Coniferol alcohol OCH 3 OH CH2CH2 CHCH COH Coniferol aldehído Ácido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH Eugenol hidroxilasa Eugenol hidroxilasa Coniferol alcohol deshidrogenasa Coniferol aldehído deshidrogenasa

5 Eugenol +H 2 18 O 18 O-Coniferol alcohol (Flavina) ? e-e- e-e- Citocromo c PMS ox. PMS red. Citocromo oxidasa e-e- ½H 2 O H2OH2O OCH 3 OH CH2CH2 Eugenol CHCH OCH 3 OH CH2CH2 CHCH CH 2 OH Coniferol alcohol ehyA/B CH2CH2

6 eugR ehyA ORF2ehyBazu Pseudomonas sp. OPS1 ehyA ORF2ehyB Pseudomonas sp. HR199 ehyB OPS1ehyA OPS1 HR199 57% 85% p-cresol metil hidroxilasa (P. putida) 34% 54%

7 La actividad se mide por los cambios en absorbancia a 600nm que se producen por la reducción de DCPIP (2,6 diclorofenol-indofenol) en presencia del sustrato y la enzima y PMS (fenazina metosulfato) Sustrato Actividad(%) Producto Eugenol p-cresol 4-etilfenol 4-n-propilfenol 4-isopropilfenol 4-n-butilfenol 4-sec-butilfenol 4-n-hexilfenol 4-n-octilfenol 4-hidroxibenzilalcohol Vanillil-alcohol Coniferil-alcohol 4-hidroxibenzaldehído 1-(4-hidroxifenil)etanol 1-(4-hidroxifenil)propanol 2-(4-hidroxifenil)propane-2-ol 1-(4-hidroxifenil)butanol 2-(4-hidroxifenil)butane-2-ol 1-(4-hidroxifenil)hexanol 1-(4-hidroxifenil)octanol 4-hidroxibenzaldehído Vainillina OCH 3 OH CH2CH2 CHCH CH2CH2 CH3CH3 R Alquil-fenoles R OH CH 2 OH 4-Hidroxi-benzil- alcoholes OCH 3 OH CH2CH2 CHCH CH 2 OH OH R R=alquil C 1 - C 7 R OH CHO R=OMe ó H Pseudomonas fluorescens E118

8 Degradación de ácido ferúlico Hay propuestas cinco rutas de degradación: 1.- Decarboxilación de la cadena lateral con formación del 4-hidroxi-3-metoxiestireno 3.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta no -oxidativa 5.- Ruptura por desacetilación para producir directamente vainillina OCH 3 CHCH OH HCHC COOH 4.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta -oxidativa 2.- Reducción del ácido ferúlico

9 Sistema de bombeo a presión Sistema de inyección Columna Detector contínuo Depósitos de disolventes 123 Sistema de gradiente Supresor pulsos Cámara mezcla Control caudal Indicador de presión ImpresoraRegistrador Colector de fracciones Control de temperatura

10 Bacillus coagulans BK07 Bacillus pumilus UI-670 Lactobacillus plantarum Bacillus subtilis B. coagulans BK07

11 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CH=CH 2 OH 4-vinil-guaiacol OCH 3 CHO OH Vainillina decarboxilación OH COOH OH Ácido protocatecuico OCH 3 COOH OH CO 2 Ácido vainíllico 1.- Decarboxilación de la cadena lateral con formación del 4-hidroxi-3-metoxiestireno

12 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CH2CH2 OH Dihidroferúlico OCH 3 CHO OH Vainillina OH COOH OH Ácido protocatecuico OCH 3 COOH OH Ácido vainíllico 2.-Reducción del ácido ferúlico 2(H) CH2CH2 COOH Burkholderia cepacia Wolinella succiongenes Pseudomonas fluorescens FE2

13 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CHCH OH HCHC COSCoA ATP CoASH Feruloil S-CoA H2OH2O OCH 3 CHOH OH COSCoA CH2CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) OCH 3 CHO OH Vainillina NAD + OCH 3 COCO OH CH2CH2 COSCoA 4-Hidroxi-3-metoxibenzoil acetil SCoA CH 3 COSCoA CoASH OCH 3 COSCoA OH CoASH NADH+H + Vainilloyl SCoA 3.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta -oxidativa Rhodotorula rubra P. putida NADH 2

14 Mezcla de reacción Rendimiento relativo de vanillato Extracto+CoA/ATP +NAD + Extracto+CoA/ATP Extracto+NAD + Extracto Buffer+CoA/ATP +NAD

15 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CHCH OH HCHC COSCoA ATP Mg 2+ CoASH Feruloil S-CoA H2OH2O OCH 3 CHOH OH COSCoA CH2CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) CH 3 COSCoA OCH 3 CHO OH Vainillina P. fluorescens AN103 P. fluorescens BF13 P. putida WCS358 P. sp. HR Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta no -oxidativa

16 Pseudomonas fluorescens AN103 MgCl 2,CoASH,ATP sin extracto prot. MgCl 2,CoASH,ATP con extracto prot. MgCl 2,CoASH,ATP,NAD + con extracto prot.

17 Pseudomonas fluorescens AN103

18 Sustrato Activ. Enzimática (nmol min -1 (mg prot) -1 Ferulato-CoA ligasaVainillina Oxidoreductasa Ácido ferúlico Vainillina Ácido Vainíllico 0 0 Ácido Succínico 0 0 La actividad ferulato-CoA ligasa se mide viendo absorbancia a 345nm, en contraste con un blanco en el que no se incluye el CoASH La actividad vainillina oxidoreductasa se mide como disminución de absorbancia a 340nm comparando con una reaccion en la que no se añade NAD +

19 Mezcla de reacción Rendimiento relativo de vanillato Extracto+CoA/ATP +NAD + Extracto+CoA/ATP Extracto+NAD + Extracto Buffer+CoA/ATP +NAD

20 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CHOH OH COOH CH2CH2 Ácido -hidroxi-hidroferúlico OCH 3 CHO OH Vainillina OCH 3 COOH OH Ácido vainíllico OCH 3 CH 2 OH OH Vainillil alcohol OCH 3 OH Guaiacol OH COOH OH Ácido 3,4-dihidroxybenzoic acid 5.- Ruptura por desacetilación para producir directamente vainillina Streptomyces setonii Pseudomonas mira Bacillus subtilis

21 Identificación de genes

22 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CHCH OH HCHC COSCoA ATP Mg 2+ CoASH Feruloil S-CoA H2OH2O OCH 3 CHOH OH COSCoA CH2CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) CH 3 COSCoA OCH 3 CHO OH Vainillina P. fluorescens AN103 P. fluorescens BF13 P. putida WCS358 P. sp. HR Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta no -oxidativa

23 Cepa Activ. Enzimática Ferulato-CoASH ligasa Vainillina:NAD + oxidoreductasa AN1038 (Fer + ) 1,7 1,2 807 Van 1 (Fer -) 0 0,05 0 Van 10 (Fer -) 2,0 1,4 59 Vanillato formado nanokatals/mg protnmol/mg prot. Pseudomonas fluorescens AN103

24 fca vdh Enoil-CoA hidratasa Vainillina:NAD + oxidoreductasa Feruloil-CoA OCH 3 CHCH OH HCHC COSCoA OCH 3 CHO OH Vainillina OCH 3 COOH OH fcavdh Ácido vainíllico 78 MVNGWCFGGG ELGGKAPFLVLADADLE 262 Pseudomonas fluorescens AN103 y BF13

25 VF

26 Cepa Feruloil-ScoA como sustrato Formación de vainillina E.coli JP2 E. coli JP2 (I) P. fluorescens AN103 nanokatals/mg prot Pseudomonas fluorescens AN103 Formación de acetil-SCoA HMPHP SCoA como sustrato Formación de vainillina Formación de acetil-SCoA Formación de feruloil-SCoA 1,5 1,8 1,5 1,8 3,4 1,2 1,3 1,3 1,5 3,2 4,2 3,3 2,9 2,7 8,3

27 fca vdh Enoil-CoA hidratasa Vainillina:NAD + oxidoreductasa Pseudomonas fluorescens AN103 ech vdh fcs Feruloil-CoA sintetasa P. sp. HR199 fca vdh P. putida WCS358 ech fcs Amycolatopsis sp. HR167 fca vdh P. fluorescens BF13 ech fcs Delftia acidovorans

28 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CHCH OH HCHC COSCoA ATP Mg 2+ CoASH Feruloil S-CoA H2OH2O OCH 3 CHOH OH COSCoA CH2CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) CH 3 COSCoA OCH 3 CHO OH Vainillina fcsech OCH 3 COOH OH Vainíllico vdh

29 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CH=CH 2 OH 4-vinil-guaiacol OCH 3 CHO OH Vainillina decarboxilación OH COOH OH Ácido protocatecuico OCH 3 COOH OH CO 2 Ácido vainíllico 1.- Decarboxilación de la cadena lateral con formación del 4-hidroxi-3-metoxiestireno

30 Bacillus subtilis

31 Degradación de ácido vainíllico

32 OCH 3 COOH OH Ácido vainíllico OCH 3 OH Guaiacol OH COOH OH Protocatecuato OCH 3 COOH O CO2CO2 Descarboxilación Desmetilación OCH 2 OH COOH OH Rhodotorula rubra

33 OCH 3 COOH OH Ácido vainíllico OCH 3 OH Guaiacol Streptomyces sp. D7 vdcBvdcC vdcD 0,6 Kb 1,4 Kb0,2 Kb VdcB tiene homología con la fenilacritado descarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae VdcC tiene homología con la4-hidroxibenzoato carboxi-liasa CO 2

34 0,5 1,5 2,5 3, ,5 1,5 2,5 3, ,5 1,5 2,5 3, Tiempo (hs.) Concentración (mM) Streptomyces lividans pCKS1 Streptomyces lividans pCKS2 Streptomyces lividans Guaiacol Vainíllico

35 OCH 3 OH -O2C-O2C Acido vainíllico OH -O2C-O2C Protocatecuato CO 2 -O2C-O2C Carboxymuconato pcaB Metabolito tóxico OCH 3 OH HC Acido ferúlico HC - OOC OH Acido p-cumárico OH Acido p-hidroxibenzóico - OOC HC - OOC Acinetobacter sp. ADP1

36 vanR vanB vanAvanK proteína similar a VanA proteína similar a ferredoxina proteína similar a PcaU proteína similar a SalA porina oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato de acetil-transferasa receptor de hierro 1Kb OCH 3 OH -O2C-O2C Acido vainíllico OH -O2C-O2C Protocatecuato OCH 2 OH OH -O2C-O2C + NAD + + H 2 O + HCHO O 2 + NADH + H + +

37 vanR vanB vanAvanK vanR vanB vanAvanK Acinetobacter sp. ADP1 Pseudomonas aeruginosa PAO1 vanR vanB vanAabc Pseudomonas putida WCS358 vanR vanB vanA Pseudomonas sp. HR199

38 Clase { { IA IB IIA IIB III Cadena transportadora de electrones OxigenasaEjemplo 4-sulfobenzoato 3,4-dioxigenasa 4-clorofenilacetato 3,4-dioxigenasa talato 4,5-dioxigenasa 2-oxo-1,2 dihidroquinolina 8-monoxigenasa benzoato 1,2-dioxigenasa dibenzofurano 4,4a-dioxigenasa benceno 1,2-dioxigenasa naftaleno 1,2-dioxigenasa FAD, [2Fe-2S] reductasa FMN, [2Fe-2S] reductasa FADreductasa [2Fe-2S] R, Fe(II) Oxigenasa (ISP ) [2Fe-2S] Ferredoxina [2Fe-2S] R Ferredoxin ISP Butler et al. (1997) Advances in Microbial Physiology

39 Familia de la p-hidroxibenzoato hidroxilasa Tamaño de subunidad, cofactorEnzima 45 kDa, FAD p-hidroxibenzoato hidroxilasa (Pseudomonas fluorescens) Salicilato hidroxilasa (NAH7) Familia de la fenol 2-hidroxilasa 65 kDa, 2-4-diclorofenol 6-monooxigenasa (pJP4) Fenol hidroxilasa (Pseudomonas EST1001) Monooxigenasas no clasificadas o-nitrofenol hidroxilasa (Pseudomonas putida B2) 4-hidroxifenilacetato 3-hidroxilasa (Pseudomonas putida) 2,4-dihidroxifenilacetato monooxigenasa (pJP4) 3-hidroxibenzoato-6- hidroxilasa (Pseudomonas cepacia) 3-hidroxibenzoato-6- hidroxilasa (Micrococcus sp.) Familia multicomponente de la fenol 2-hidroxilasa Fenol 2-hidroxilasa (Pseudomonas CF600) Tolueno 4-monooxigenasa (Pseudomonas mendocina) kDa, Fe(II) 65 kDa, FAD? 44 kDa, FAD? 32 kDa 44 kDa, FAD 70 kDa, FAD

40 Familia de las alcano hidroxilasas Tamaño de subunidad, cofactorEnzima 41 kDa, Fe(II) Alcano hidroxilasa (ALK) Xileno monooxigenasa (TOL) Metano monooxigenasa (Methylosinus trichosporium) Canfor 5-monooxigenasa (CAM) P-450 mitocondrial (Eucariotas) Fenil alanina-4- hidroxilasa (Eucariotas) Tirosina 3- hidroxilasa (Eucariotas) 4-Metoxibenzoato monooxigenasa (Pseudomonas putida) Tolueno sulfonato metil-monooxigenasa (Comamonas testosteroni) 120 kDa 52 kDa 59 kDa Hidroxilasas de grupo alquilo A ( kDa) B(16kDa) Vanillato demetilasa (Pseudomonas sp.)(34 kDa) n No clasificadas (40 kDa) 3, Fe(II) [2Fe-2S] R (43 kDa) 3, o (40 kDa) 4 Familia de las citocromo P450 monooxigenasas P-450 microsomal(Eucariotas) Citocromo P-450 bm-3 (Bacillus megaterium) Familia de las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos Triptofano hidroxilasa (Eucariotas) 51 kDa

41 FCPHRGAPLSLGYVEDGHLVCGYHGL CDYRLMIDNLMDLTHETYVHSS DRWQRCHFFAPSNVHI MLEQQQQNIV Sitio de unión a hierro de tipo Rieske Sitio activo de unión a hierro 300 VanA LTRQYSL AGGTGT CEQGTCGTCITR Sitio de unión a FMN Sitio de unión a NAD ribosa Sitio de unión a hierro-azufre VanB

42 -02C-02C OH OCH 3 100% Vanillate OH -02C-02C Protocatecuato m-Hydroxibenzoato OCH 3 -02C-02C m-Anisate OH -02C-02C 100% 9% CH 3 -02C-02C OH CH 3 4-Hydroxi-3,5 dimetil-benzoato CH 2 OH -02C-02C OH CH 3 3-Hydroximetil-4-hidroxi 5-metilbenzoato 85% 10% 3,4-dimetoxibenzoato OCH 3 -02C-02C 100% 22% OH -02C-02C OCH 3 Isovanillato CH 3 -02C-02C m-toluato 100% 7% CH 2 OH -02C-02C 3-hidroximetilbenzoato CH 3 -02C-02C 3,4-dimetilbenzoato CH 2 OH -02C-02C CH 3 3-hidroximetil, 4-metilbenzoato 100% 5% 3,4,5-trimetoxibenzoato OCH 3 -02C-02C OH -02C-02C OCH 3 3-hidroxi, 4,5-dimetoxibenzoato 70% 0%

43 ATTGATGCTGAATATCGATGCTGGCGGGGT ATTGATGCTG CGGGGT vanA vanA vanB vanA673 ATTGATGCTGAATATCGATGCTGGCGGGGT 50pb del Tn10 TGCTGAATA vanA675 TGCGCAGCGGCTATGCC TGTAGGCGGCTTCCCC 50pb del Tn TGCGCAGCG AGGCATTTGCGGCACCTGTATTA A vanA TAACTGTTGTAGTGAACAACATCGCTATGTG Tn5613AAC vanA647 AACACTTCCC? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Tn5613? ? ? ? vanA TAACTGTTGTAGTGAACAACATCGCTATGTG IS1236?AAC vanA657 CAACAACTGACCGACCAGATTCGTGAAGGACAA IS1236? AGA vanA6450

44 vanR vanB vanAvanK Acinetobacter sp. ADP Concentración metabolito (mM) Tiempo (h) Protocatecuato Vanillato Wild-type VanR -

45 wt/ni c e wt/iR - /ni vanR vanB vanAvanK

46 -02C-02C OH OCH 3 Vanillate OH -02C-02C Protocatecuato [Co III ]-CH 3 [Co I ] FH 4 CH 3 -FH 4 [Co II ] e-e- e - +ATP AE MTII MTI -02C-02C OH OCH 3 CH 3 -FH 4 CO 2 6[H] 3CO 2 3CO 3acetil-CoA 3CH 3 -COO - -02C-02C OH OCH 3 3 3CH 3 -FH 4

47 OH -O2C-O2C HO Quinato OH -O2C-O2C Protocatecuato OH -O2C-O2C O HO OH DehidroquinatoDehidrosiquimato OH -O2C-O2C O -O2C-O2C Siquimato OH Dehidroquimato Dehidrosiquimato Siquimato Corismato Aminoácidos aromáticos Fosfoenolpiruvato + eritrosa 4-fosfato VanKPcaK T= 0 hs. qui, pcaBCK1 ADP1 pcaK vanK pcaK T= 5 hs. Citoplasma Periplasma Mb. interna Mb. externa QuiA QuiB QuiC

48 Biotransformaciones

49 En general los rendimientos obtenidos en biotransformaciones de 1gr/l, que no son económicamente interesantes Comenzando del producto de degradación de lignina, se puede obtener vainillina con un rendimiento del 10% y con un precio de mercado por debajo de 15$/kg. La vainillina natural de las judías de vainilla puede alcanzar un precio 300 veces más alto que el de la vainillina sintética. El 80% de los aromas y fragancias que se comercializan, se producen químicamente y sin embargo, el 70% de los consumidos en Alemania son naturales El mercado de los aromas está creciendo rápidamente, y se comercializan varios cientos de toneladas al año, estimándose un negocio de unas 9,7 billones de $ en 1994

50 Ferúlico Vainíllico Vainillina D.O. Tiempo (h) D.O (KU) Concentración (mM) Delftia acidovorans

51 Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CHO OH Vainillina OCH 3 COOH OH fca vdh Ácido vainíllico

52 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1, Ferúlico Vainíllico Vainillina 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1, Pseudomonas putida Streptomyces setonii Identificación de cepas con mayor capacidad de biotransformación Metabolitos gr/l Tiempo (h)

53 Ferúlico Vainillina Vainíllico Tiempo (h) Metabolitos (gr/l) Mejora de condiciones de cultivo

54 mg/ml 2mg/ml 4mg/ml 6mg/ml 8mg/ml Rendimiento (%) Tiempo (h) P. fluorescens BF13 Variaciones en fuentes de carbono

55 0 0,2 0,4 0,6 0, p-cumárico succinico glucosa m-cumárico ferúlico glutámico mg/ml vanillic Tiempo (h) P. fluorescens BF13

56 Utilización de mutantes en la biotransformación 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0, Sin extracto de levadura Con extracto de levadura Tiempo (hs) Vanillato (mg/ml) Glucosa + 0.1%ferúlico vanB vanA OCH 3 COOH OH Ácido vainíllico OH COOH OH Protocatecuato En ferúlico son dos veces más activas El silvestre como mucho acumula 0,2mg/ml

57 Utilización de mutantes en la biotransformación ech vdh fcs Feruloil-CoA sintetasa Vainillina:NAD + oxido-reductasa EnoilCoA hidratasa Acido ferúlico OCH 3 CHCH OH HCHC COOH OCH 3 CHO OH Vainillina OCH 3 COOH OH fcs/ech vdh Ácido vainíllico Pseudomonas sp. HR199

58 Ferulato Coniferil aldehído Coniferil alcohol Vanillato 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 5h15h18h 3,0 2,0 1,0 5h15h18h Vainillina Metabolitos (mM) 0,5gr/l


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