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Problema Tasa de deforestación Catalogada como conífera en riesgo menor Multiplicar masivamente Preocupación por una acelerada eliminación Justificación.

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Presentación del tema: "Problema Tasa de deforestación Catalogada como conífera en riesgo menor Multiplicar masivamente Preocupación por una acelerada eliminación Justificación."— Transcripción de la presentación:

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2 Problema Tasa de deforestación Catalogada como conífera en riesgo menor Multiplicar masivamente Preocupación por una acelerada eliminación Justificación Bosques selectivamente extraídos Impacto ecológico y económico Callogénesis Disminución de la diversidad Estabilidad ambiental Embriogénesis somática indirecta Fuente renovable y sustentable No existen investigaciones Podocarpus oleifolius

3 General Específicos

4 La variación del medio de cultivo y las diferentes dosis de reguladores de crecimiento induce de manera directa la formación y proliferación de callo embriogénico in vitro de meristemos apicales de árboles juveniles de Podocarpus oleifolius.

5 Podocarpus oleifolius Romerillo Conífera autóctona del Ecuador Árboles de hasta 45 m de altura Bosques húmedos Apreciado por su madera 1500 – 3000 m.s.n.m Planes de reforestación Mueblería fina, tallados, puertas, etc. Siempre verde, con fuste recto Forestal

6 A nivel sudamericano Costa Rica, El Salvador, Panamá, Honduras, México Distribución geográfica A nivel nacional En el Distrito Metropolitano de Quito Cañar, Cotopaxi, Azuay, Loja Estribaciones del Volcán Guagua Pichincha Lloa, Bosque Tandacato Nono, Nanegal, Nanegalito San José de Minas, Calacalí y Gualea

7 Aspectos Reproductivos Semillas – trat. pre-germinativo Sexual Asexual Estacas o acodos de raíz y ramas Descripción botánica Hojas lanceoladas Hojas – Punta espinosa Conos masculinos laterales Conos masculinos laterales Aspectos reproductivos Sexual Conos femeninos en pedúnculos axilares Árbol dioco

8 Proceso de callogénesis Proceso de Embriogénesis Somática Indirecta

9 Vivero la Armenia - Conocoto Selección y colecta del material vegetal Laboratorio de Micropropagación EPMMOP Fase de campo Fase de laboratorio Yemas apicales Proliferación de callo embriogénico Identificación del callo embriogénico Inducción a callo embriogénico Desinfección y establecimiento

10 Yemas apicales Lavado con detergente Tratamientos Alcohol Tiempo (min) (NaClO) (v/v) Tiempo (min) 1--1.5%15 270%11.5%15 3--1%10 Aplicación de tratamientos de desinfección Siembra meristemo Disección de brácteas Extracción del meristemo Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 16/8horas luz/ oscuridad Variable: sobrevivencia

11 Desinfección Siembra Meristemo Extracción del meristemo Incubación de meristemos en oscuridad Tratamiento Medio de Cultivo Reguladores evaluados para cada medio (mg/L) Thidiazurón (mg/L) 2,4-DBAPIAA Control 1MS0000 1 10.100 2MS0000.1 3MS30.500 4MS0120 Control 2MS/20000 5 10.100 6MS/20000.1 7MS/230.500 8MS/20120 Análisis Macro-morfológico Friabilidad Color Friabilidad Color 2da Inducción Inducción a callo embriogénico – primer ensayo Tratamiento Medio de Cultivo Reguladores evaluados para cada medio (mg/L) Sacarosa (g/L) Mioinositol (mg/L) 2,4-DBAPKIN Control 1MS0003010 1MS30.503010 2MS300.53010 3MS3003010 Control 2MS0004510 4MS30.504510 5MS300.54510 6MS3004510 Inducción a callo embriogénico – segundo ensayo Evaluación: 30, 40, 50 y 60 días Variables evaluadas: Mejor tratamiento Tiempo de inducción Variables evaluadas: Mejor tratamiento Tiempo de inducción Identificación del callo embriogénico

12 A partir de porciones de callo - 0.5 mm Tinción con acetocarmín al 2% - 15 Lavado con agua destilada Observación al microscopio óptico 100 x A partir de porciones de callo - 0.5 mm Tinción con acetocarmín al 2% - 15 Lavado con agua destilada Observación al microscopio óptico 100 x Análisis Macro-morfológico Friabilidad Color Friabilidad Color 1 2 Análisis Histológico

13 Proliferación Callos embriogénicos Dividir en tres partes iguales el callo y pesarlos en la balanza electrónica analítica. Sembrar tres porciones de callo TratamientoMedio Reguladores de crecimiento (mg/L) Incubación 2,4-DBAP Luz Directa (L) Oscuridad (O) 1MS21L- 2 21-O Variables evaluadas: Diferencia del peso de las porciones de callo luego de 30 días. Variables evaluadas: Diferencia del peso de las porciones de callo luego de 30 días.

14 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Desinfección y establecimiento Tabla 1: Datos de frecuencia y porcentaje de las variables: mortalidad y sobrevivencia de los meristemos apicales de romerillo, obtenidos en la fase de desinfección después de 21 días. Estado de los explantes Tratamientos de desinfección Total 123 Descartados 2014539 66.7%46.7%16.7%43.3% Sobrevivencia 10162551 33.3%53.3%83.3%56.7% Total 30 90 100.0% Figura 1: Porcentajes de las variables: sobrevivencia y mortalidad, evaluadas en la etapa de desinfección después de 21 días. Tratamientos Alcohol Tiempo (min) (NaClO) (v/v) Tiempo (min) 1--1.5%15 270%11.5%15 3--1%10

15 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 2: Frecuencias y porcentajes de los diferentes agentes causales responsables del descarte de los meristemos apicales de romerillo durante la fase de desinfección después de 21 días. Agentes causales Tratamientos Total 123 Bacteria 4239 13.3%6.7%10.0% Hongo 1001 3.3%0% 1.1% Necrosis 118120 36.7%26.7%3.3%22.2% Oxidados 4419 13.3% 3.3%10.0% Vivos 10162551 33.3%53.3%83.3%56.7% Total 30 90 100.0% Desinfección y establecimiento Hongo Bacteria Necrosis

16 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Porcentajes de los diferentes agentes causales responsables del descarte de los meristemos apicales de romerillo después de 21 días. Figura 2: Porcentajes de los diferentes agentes causales responsables del descarte de los meristemos apicales de romerillo después de 21 días. Desinfección y establecimiento

17 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 3: Análisis de varianza para los diferentes tratamientos de desinfección. Fuente de variación Suma de cuadrados Gl Media cuadrática Valor FValor ρ Tratamientos3.821.99.0330.00 Error18.3870.21 Total22.189 Desinfección y establecimiento F calculado (9.033) > F crítica (3.101)

18 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 4: Frecuencias y porcentajes de los meristemos establecidos a los 21 días después de ser aplicados los tratamientos de desinfección. Estado de los explantes Tratamientos de desinfección Total 123 No establecido 813627 80.0%81.3%24.0%52.9% Establecido 231924 20.0%18.8%76.0%47.1% Total 10162551 100.0% Desinfección y establecimiento Porcentaje de los meristemos establecidos y no establecidos en la etapa de desinfección después de 21 días. Figura 3: Porcentaje de los meristemos establecidos y no establecidos en la etapa de desinfección después de 21 días.

19 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Inducción de callo embriogénico – primer ensayo Tabla 5: Frecuencias y porcentajes de formación de callo a partir de meristemos apicales de romerillo durante la fase de inducción – primer ensayo, después de 60 días. Tratamientos de inducción Estado de los explantes Total Ausencia de callo Formación de callo Descartados C1 180220 90.0%0%10.0%100.0% T1 154120 75%20%5.0%100.0% T2 182020 90%10.0%0%100.0% T3 515020 25.0%75.0%0%100.0% T4 162220 80%10.0% 100.0% C2 2000 100.0%0% 100.0% T5 172120 85.0%10.0%5.0%100.0% T6 180220 90.0%0%10.0%100.0% T7 164020 80.0%20.0%0%100.0% T8 2000 100.0%0% 100.0% Total 163298200 81.5%14.5%4.0%100.0% Tabla 6: Frecuencias de la formación de callo a partir de meristemos durante la fase de inducción – primer ensayo, evaluados a los 30, 40, 50 y 60 días. Tratamiento30 días40 días50 días60 días C10000 T10130 T20002 T301410 T40002 C20000 T50002 T60000 T70004 T80000

20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 4: Número de callos formados en los diferentes tratamientos de inducción evaluados a los 60 días. Inducción de callo embriogénico – primer ensayo Figura 5: Número de callos formados a los 30, 40, 50 y 60 días en los diferentes tratamientos de inducción. A los 30 díasA los 60 díasA los 30 díasA los 60 díasA los 30 díasA los 60 díasA los 30 díasA los 60 días A los 30 díasA los 60 díasA los 30 díasA los 60 díasA los 30 díasA los 60 días

21 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 7: Identificación de callos embriogénicos presentes en el tercer tratamiento del primer ensayo de inducción. Tratamiento 3 MS (3 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BAP) Características de callos embriogénicos Callos no embriogénicos Friable Color amarillo a café Translúcido 1X 2XXX 3XXX 4XXX 5XXX 6XXX 7X 8X 9X 10XXX 11XXX 12XXX 13XXX 14XXX 15X X: Cumple con las características de los callos embriogénicos. Inducción de callo embriogénico – primer ensayo 30 días40 días 50 días60 días

22 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 8: Porcentajes de callos embriogénicos formados en el tercer tratamiento, del primer ensayo de inducción. Tratamiento 3 Callos embriogénicos Callos no embriogénicos Total T3 10515 66.7%33.3%100% Total10515 Inducción de callo embriogénico – primer ensayo Callo embriogénicoCallo no embriogénico

23 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 9: Análisis de varianza para las variables: formación de callos y tiempo – primer ensayo. Fuente de variación Suma de cuadrados Gl Media cuadrática Valor FValor ρ Valor crítico para F Tratamientos66.409.007.372.000.072.25 Días32.603.0010.862.950.052.96 Error99.4027.003.68 Total198.4039.00 Inducción de callo embriogénico – primer ensayo F calculado (2.95) < F crítica (2.96) F calculado (2.00) < F crítica (2.25) Tratamientos: Días:

24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 10: Frecuencias y porcentajes de formación de callo embriogénico a partir de meristemos apicales de romerillo durante la fase de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 60 días... Tratamientos de Inducción Estado de los explantes Total Ausencia de callo Formación de callo Descartado s C1 190120 95.0%0%5.0%100.0% T1 613120 30.0%65.0%5.0%100.0% T2 119020 55.0%45.0%0%100.0% T3 135220 65.0%25.0%10.0%100.0% C2 190120 95.0%0%5.0%100.0% T4 515020 25.0%75.0%0%100.0% T5 910120 45.0%50.0%5.0%100.0% T6 911020 45.0%55.0%0%100.0% Total 91636160 56.9%39.4%3.7%100.0% Inducción de callo embriogénico – segundo ensayo Tratamiento50 días60 días Ausencia de callo Total C1 0020 0% 100% T1 310720 15%50%35%100% T2 361120 15%30%55%100% T3 141520 5%20%75%100% C2 0020 0% 100% T4 312520 15%60%25%100% T5 371020 20%35%50%100% T6 29920 10%45% 100% Total 154897160 9.38%30%60.62%100% Tabla 11: Frecuencias y porcentajes de la formación de callo embriogénico a partir de meristemos apicales de romerillo, durante la fase de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 50 y 60 días.

25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 6: Número de callos embriogénicos formados en los diferentes tratamientos de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 60 días. Inducción de callo embriogénico – segundo ensayo Figura 7: Número de callos embriogénicos formados en los diferentes tratamientos de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 50 y 60 días. A los 50 díasA los 60 días A los 50 díasA los 60 días Tratamiento 1: MS (3 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BAP) + 30gsacarosa + mioinositol Tratamiento 4: MS (3 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BAP) + 45gsacarosa + mioinositol

26 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 12: Análisis de varianza para las variables: formación de callos y tiempo – segundo ensayo. Fuente de variación Suma de cuadrado s Gl Media cuadrática Valor FValor ρ Valor crítico para F Tratamientos112.447.0016.062.920.093.78 Días68.061.0068.0612.390.005.59 Error38.447.005.49 Total218.9415.00 Inducción de callo embriogénico – segundo ensayo F calculado (12.39) > F crítica (5.59) F calculado (2.92) < F crítica (3.78) Tratamientos: Días:

27 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis morfológico – primer ensayo Callo compacto de color blanco tomado del primer tratamiento, el cual no presenta características morfológicas de un callo embriogénico. Meristemo de romerillo tomado del octavo tratamiento que no formó callo. Callo translúcido, friable de color amarillo-verde, tomado del tercer tratamiento que dio los mejores resultados en la formación de callo embriogénico.

28 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis morfológico e histológico – segundo ensayo Observación al estereoscopio del callo embriogénico. Callo translúcido, friable tomado del cuarto tratamiento Tinción con acetocarmín 2% (p/v) Agregados de células redondas Citoplasma denso Núcleo grande 100x

29 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 13: Resultados de callos embriogénicos sometidos a proliferación en diferentes estados de incubación, evaluados después de 30 días. Estado de incubación: Luz Porciones de callo Peso inicial (g) Peso final (g) Diferencia (g)Observaciones 10.05400Necrosados 20.04300Necrosados 30.07000Necrosados 40.05900Necrosados 50.07600Necrosados 60.04500Necrosados 70.08000Necrosados 80.03500Necrosados 90.07000Necrosados Estado de incubación: Oscuridad Porciones de callo Peso inicial (g) Peso final (g) Diferencia (g) Observaciones 10.0780.1590.081 20.0690.1300.061 30.0750.1550.08 40.05700Necrosados 50.04100Necrosados 60.06500Necrosados 70.05900Necrosados 80.07800Necrosados 90.06800Necrosados Proliferación de callo embriogénico

30 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 14: Prueba inferencial – intervalo de confianza de los pesos obtenidos en la proliferación de callo embriogénico, en estado de oscuridad. Proliferación de callo embriogénico VariableParámetroEstimaciónE.E.nLI (95%)LS (95%) Diferencia de pesos Media0.070.0130.050.10 Figura 8: Callos necrosados después de 30 días de evaluados en la etapa de proliferación. Figura 9: Proliferación de callos embriogénicos después de 30 días de evaluados. A. Zona del callo de color verde aún viable. B. Zona del callo embriogénico en proceso de necrosis.

31 CONCLUSIONES El mejor tratamiento de desinfección es el tratamiento con hipoclorito de sodio (NaClO) a una concentración de 1% durante 10 minutos con un lavado previo de las yemas apicales en una solución de detergente durante 40 minutos. La mejor formulación nutritiva evaluada para el establecimiento e inducción es el medio MS a su concentración completa. Con el cuarto tratamiento (3 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BAP + 45 g/L sacarosa + 10 mg/L mioinositol) del segundo ensayo, se obtiene un porcentaje de 23.8% callos embriogénicos de un total de 63 callos embriogénicos formados en todos los tratamientos, siendo el más óptimo para la inducción a callogénesis in vitro de meristemos apicales de árboles jóvenes de Podocarpus oleifolius. Los callos embriogénicos formados a partir de los meristemos apicales de romerillo son callos translúcidos, friables y de color amarillento. Histológicamente el tejido embriogénico presenta agregados con células redondas e isodiamétricas, citoplasma denso, núcleo grande y la presencia de células meristemáticas. La proliferación de los callos embriogénicos se da en condiciones de oscuridad, pero se ve afectada por el necrosamiento del tejido siendo el medio MS + 2 mg/L 2,4-D + 1 mg/L BAP el adecuado para la proliferación del callo embriogénico evaluado.

32 RECOMENDACIONES Realizar más repeticiones en las diferentes etapas de la presente investigación a fin de poder encontrar mejores diferencias significativas Validar los supuestos de los diseños experimentales empleados, utilizar comparaciones o pruebas de rango múltiple para las medias de los tratamientos y emplear técnicas estadísticas no paramétricas y de regresión logística Probar diferentes concentraciones y combinaciones de Thidiazurón con otros reguladores de crecimiento en el proceso de callogénesis de meristemos apicales de romerillo para evaluar su respuesta. Efect uar nuev os estu dios utiliz ando difer ente s com bina cion es y dosis de regul ador es de creci mien to, para eval uar el efect o de las mis mas en el proc eso de callo géne sis de meri stem os apic ales de rome rillo. Realizar investigaciones de suspensiones celulares y embriogénesis somática a partir de los callos formados en el proceso de callogénesis establecido. Investigar el proceso de callogénesis a partir de otros tipos de explantes tomados de árboles jóvenes de romerillo.

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