La descarga está en progreso. Por favor, espere

La descarga está en progreso. Por favor, espere

ESTUDIO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL GEN RET COMO INDICADORES DE RIESGO PARA EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG EN NIÑOS ATENDIDOS.

Presentaciones similares


Presentación del tema: "ESTUDIO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL GEN RET COMO INDICADORES DE RIESGO PARA EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG EN NIÑOS ATENDIDOS."— Transcripción de la presentación:

1 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL GEN RET COMO INDICADORES DE RIESGO PARA EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG EN NIÑOS ATENDIDOS EN EL HOSPITAL PEDIÁTRICO BACA ORTIZ DE LA CIUDAD DE QUITO, MEDIANTE PCR- RFLP María José Guevara Lema Director: Dr. Marcelo Grijalva, MD., Ph. D. Codirectora: Ing. Paola Párraga

2 Introducción Materiales y Métodos Resultados Conclusiones Recomendaciones

3 Sistema Nervioso Entérico Representación de las neuronas entéricas en los plexos mientérico y submucoso en el tracto intestinal (McPhee & Hammer, 2010) Red compleja de neuronas y sus células de sostén (glía) Rige los movimientos gastrointestinales Controla la secreción y el flujo sanguíneo local Mucosa

4 Sistema Nervioso Entérico - Origen Colonización del intestino por precursores procedentes de tres regiones distintas de la cresta neural (Sánchez, 2010). VNC: Cresta neural vagal; TNC: Cresta neural troncal; SNC: Cresta neural sacra

5 Enfermedad de Hirschsprung Harald Hirschsrprung (Briceño, 2002)

6 Aganglionosis Plexo Mientérico Submucoso Meissner Enfermedad de Hirschsprung Fenotipo de HSCR. Abdomen distendido (Passarge,2002) Representación del megacolon (Cochard, 2012) Trastorno congénito de motilidad intestinal en RN Representación esquemática de un corte transversal del intestino. (Heanue & Pachnis, 2007)

7 % Enfermedad de Hirschsprung - Tipos Representación del intestino grueso (Sánchez, 2010) HSCR segmento corto

8 % HSCR segmento corto HSCR segmento largo Enfermedad de Hirschsprung - Tipos % Representación del intestino grueso (Sánchez, 2010)

9 % % 3 – 8 % HSCR segmento corto HSCR segmento largo TCA Enfermedad de Hirschsprung - Tipos Representación del intestino grueso (Sánchez, 2010)

10 Enfermedad de Hirschsprung – Síntomas – Diagnóstico Síntomas Obstrucción intestinal Dificultad en expulsar el meconio Distensión abdominal Vómitos Enterocolitis neonatal Diagnóstico Sospecha clínica Visualización abdominal Estudio histológico Tratamiento Intervenciones quirúrgicas Desde 1980 la mortalidad ha estado por debajo del 6%

11 1.5/ / Global: 1/5000 RNV 2.8/ Epidemiología Enfermedad de Hirschsprung – Epidemiología 2.1/ HSCR Esporádico Familiar Aislado 80% Autosómica dominante o recesiva Sexo-dependiente Ratio 4:1 Penetrancia incompleta 30% coexisten con otras alteraciones o síndromes Representación de la incidencia de HSCR en diferentes grupos étnicos

12 Etiología Enfermedad de Hirschsprung – Etiología Representación de las rutas de señalización e interacción, que rigen en el desarrollo del SNE(Modificado Tam & Garcia, 2004). No. insuficiente Diferenciación incorrecta Imposibilita la formación de ganglios entéricos capacidad contráctil Peristaltismo inefectivo y estrechamiento del segmento afectado MEGACOLON

13 Etiología Enfermedad de Hirschsprung – Etiología – RET RET gene RET protein Extracellular domain (28-635) TMD ( ) Intracellular domain ( ) Receptor de membrana (tirosín quinasa) PM ~ 124kDa Receptor de membrana (tirosín quinasa) PM ~ 124kDa Esquema del Cromosoma 10. Gen RET localizado en la región 10q11.2 (GeneCards)

14 Etiología Enfermedad de Hirschsprung – Etiología – Mutaciones silenciosas RET HSCR c135G>A rs c1296G>A rs c2712C>G rs IVS1+1813C>T rs Mutaciones sinónimas e intrónicas Afecta el correcto procesamiento del ARNm ARNm alterados o proteínas truncadas Pérdida de función Mal plegamiento de proteína Falta de transporte en la superficie celular Supresión de su actividad biológica Representación esquemática de los SNPs estudiados, en el Gen RET. (Modificado Burzynski, et al., 2004).

15 Técnicas Moleculares Extracción y cuantificación de ADN PCRPCR-RFLPSecuenciación

16 Técnicas Moleculares Extracción y cuantificación de ADN PCRPCR-RFLPSecuenciación

17 Técnicas Moleculares Extracción y cuantificación de ADN PCRPCR-RFLPSecuenciación

18 Técnicas Moleculares Extracción y cuantificación de ADN PCRPCR-RFLPSecuenciación

19 Técnicas Moleculares Extracción y cuantificación de ADN PCRPCR-RFLPSecuenciación Incorporación de terminadores (ddNTPs) a una nueva cadena de ADN mediante la actividad de la ADN polimerasa. H P O OH O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Trifosfato H Dideoxinucleótido Trifosfosfato (ddNTP) Deoxinucleótido Trifosfato (dNTP) O OH OP O HOP O dNTP es análogo ddNTP

20 ESQUELETO AZUCAR - FOSFATO H P O HO O O CH 2 HOH P O O HO O O CH 2 H P O OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N O O N NH N N N O NH 2 N B A S E S Los ddNTPs terminan la síntesis del DNA O H P O HO O O CH 2 HO O H2NH2N N HN N N H HOH P O O O CH 2 CH 3 O O HN N OH H P HO O O CH 2 H O N O H2NH2N N H2OH2O 23dideoxinucleótido Los dNTPs continúan la síntesis del DNA

21 Longitud de onda (nm) Intensidad de la Emisión Normalizada Dye 1 Dye 2 Dye 3 Dye 4 Ciclo de Secuenciación de Dye Terminator (Applied Biosystems, 2009) Técnicas Moleculares - Secuenciación Emisión espectral de los cuatro tintes BigDye (Applied Biosystems, 2009) Dye 1 = Big-d110,Dye 2 = R6G, Dye 3 = Big-dTAMRA y Dye 4 = Big-dROX CTA G Secuenciación cíclica Marcadores fluorescentes

22 Objetivos Estandarizar la técnica de extracción de ADN Optimizar las condiciones de PCR-RFLP Determinar la frecuencia en afectos y control Analizar los polimorfismos de un solo nucleótido de los exones 2, 7 y 15; y la región IVS del gen RET, mediante PCR-RFLP, de un grupo de niños con Hirschsprung atendidos en el Hospital Pediátrico Baca Ortiz de la ciudad de Quito.

23 Introducción Materiales y Métodos Resultados Conclusiones Recomendaciones

24 Participantes Hospital Machachi (Área de Salud No.16).

25 Diseño Diseño experimental Estudio caso control82 muestras Análisis estadístico de tipo descriptivo Frecuencias alélicas y genotípicas HWE Análisis de asociación del polimorfismo con la enfermedad

26 1. Obtención de muestras 4. Análisis de Datos 2. Extracción y cuantificación de ADN 3. Determinación del genotipo Casos: 41 Biopsias HBO ( ) Controles: 20 HBO y 21 HM Procedimiento Kit Quant-iT TM dsDNA BR Assay PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen PCR PCR-RFLP Exones: 2, 7 y 15Intrón 1 Frecuencia alélica y genotípica HWE χ 2 OR Secuenciación Fotografía de biopsias parafinadas de colon Fotografía del tejido de colon procesado

27 Procedimiento – Secuenciación Producto de PCR Cuantificación por electroforesis Purificación AMPure XP Preparación del templado M Fotografía de un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio de los resultados de la amplificación del intrón 1. Procedimiento utilizado en la purificación del producto de PCR, mediante Ampure XP (Beckman Coulter, Inc. 2009) Fotografía en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio para la cuantificación por electroforesis M µL 3 µL2 µL

28 Producto de PCR Cuantificación por electroforesis Purificación AMPure XP Preparación del templado Rx de Secuenciac. BigDye Terminator v3.1 Purificación CleanSEQ Reacción de Secuenciación Electroforesis capilar 3130 Genetic Analyzer Procedimiento utilizado en la purificación de la reacción de secuenciación, mediante CleanSEQ (Beckman Coulter, Inc. 2006) Procedimiento – Secuenciación Reactivos Concentración inicial Concentración Final Volumen 1x (µL) PCR3 –10 ng Cebador Fw10 µM3.2 pmol3.2 Buffer BigDye 45 X1 X2 BigDye v Agua ultra pura--c.s. Volumen total 10 Concentraciones y volúmenes de reactivos utilizados para la reacción de secuenciación de la región intrónica. c.s: cantidad suficiente N CiclosTemperaturaTiempo 196 C3 min C10 seg 50 C5 seg 60 C4 min 14 C Secuenciador automático ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, 2009) Programa de condiciones térmicas del ciclo de secuenciación. (Applied Biosystems, 2009).

29 Análisis del electroferograma Sequencing Analysis Software v5.2 Análisis de datos Producto de PCR Cuantificación por electroforesis Purificación AMPure XP Preparación del templado Rx de Secuenciac. BigDye Terminator v3.1 Purificación CleanSEQ Reacción de Secuenciación Electroforesis capilar 3130 Genetic Analyzer Procedimiento – Secuenciación Fotografía de un electroferograma

30 Introducción Materiales y Métodos Resultados Conclusiones Recomendaciones

31 Edad y Sexo Distribución etaria de los pacientes con HSCR. Distribución de los casos controles y afectos, por género. Edad GrupoRango (años)Promedio (años) Afecto0.042 a 112,86 ± 2.74 Control0.061 a 123,97 ± 3.54 Edad promedio de los grupos afecto y control

32 Embebidas en parafina Sangre periférica Concentración de ADN Grupo Rango (ng/μL) Promedio (ng/μL) Afectos43 a ± Controles11 a 13556,91 ± Extracción y concentración de ADN Concentración promedio de los grupos afecto y control M CN Fotografía de un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio. 1 – 9: Muestras, CN: Control negativo M CN Fotografía de un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio. 1 – 9: Muestras, CN: Control negativo

33 Determinación del genotipo – PCR - RFLP Reactivos Concentración inicial Concentración Final Volumen 1x (µL) ADN10 ng3 Buffer10 X1 X5 MgCl 2 50 mM2 mM2 dNTP's10 mM0,2 mM1 Cebador Fw10 µM0,2 μM1 Cebador Rv10 µM0,2 μM1 Platinum Taq Pol5 U/µL1.5 U0.3 Agua ultra pura Volumen total 50 Concentraciones y volúmenes de reactivos utilizados para la PCR del exón 2 N CiclosTemperaturaTiempo 195 C10 min C30 seg 59.6 C45 seg 72 C45 seg 172 C4 min 14 C Programa de amplificación del exón 2 del gen RET. M Fotografía de un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio de los resultados de la amplificación del exón Fotograf í a de un gel de agarosa al 4 % te ñ ido con bromuro de etidio de los resultados de la digesti ó n enzim á tica con EagI M GA GG AA 5 C GGCC G 3 3 G CCGGC 5

34 Determinación del genotipo – PCR - RFLP Fotografía del resultado de secuenciación del exón 2. Electroferogramas del Homocigoto GG, Heterocigoto GA y Homocigoto AA.

35 Determinación del genotipo – PCR - RFLP Reactivos Concentración inicial Concentración Final Volumen 1x (µL) ADN10 ng3 Buffer10 X1 X5 MgCl 2 50 mM1 mM1 dNTP's10 mM0,2 mM1 Cebador Fw10 µM0,2 μM1 Cebador Rv10 µM0,2 μM1 Platinum Taq Pol5 U/µL1.5 U0.3 Agua ultra pura 37.7 Volumen total 50 Concentraciones y volúmenes de reactivos utilizados para la PCR del exón 7 N CiclosTemperaturaTiempo 195 C10 min C30 seg 58.3 C45 seg 72 C45 seg 172 C4 min 14 C Programa de amplificación del exón 7, gen RET. M Figura: Fotografía de un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio de los resultados de la amplificación del exón M GA GG AA Figura: Fotografía de un gel de agarosa al 4 % teñido con bromuro de etidio de los resultados de la digestión enzimática con BsmI ´... GAATGC N.. 3´ 3´... CTTAC G... 5´ Fotografía del resultado de secuenciación del exón 7. Electroferogramas del Homocigoto GG, Heterocigoto GA y Homocigoto AA

36 Determinación del genotipo – PCR - RFLP Reactivos Concentración inicial Concentración Final Volumen 1x (µL) ADN10 ng3 Buffer10 X1 X5 MgCl 2 50 mM2 mM2 dNTP's10 mM0,4 mM2 Cebador Fw10 µM0,2 μM1 Cebador Rv10 µM0,2 μM1 Platinum Taq Pol5 U/µL1.5 U0.3 Agua ultra pura 35.7 Volumen total 50 N CiclosTemperaturaTiempo 195 C10 min C30 seg 61.6 C45 seg 72 C50 seg 172 C4 min 14 C Programa de amplificación del exón 15 del gen RETConcentraciones y volúmenes de reactivos utilizados para la PCR del exón Fotografía de un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio de los resultados de la amplificación del exón 15. M Fotografía de un gel de agarosa al 4 % teñido con bromuro de etidio de los resultados de la digestión enzimática con RsaI M GC CC GG GT AC 3 3 CA TG 5

37 Determinación del genotipo – Secuenciación Reactivos Concentración inicial Concentración Final Volumen 1x (µL) ADN10 ng3 Buffer10 X1 X5 MgCl 2 50 mM1 mM1 dNTP's10 mM0,2 mM1 Cebador Fw10 µM0,2 μM1 Cebador Rv10 µM0,2 μM1 Platinum Taq Pol5 U/µL2 U0.4 Agua ultra pura 37.6 Volumen total 50 N CiclosTemperaturaTiempo 195 C10 min C30 seg 58.9 C45 seg 72 C1 min 172 C4 min 14 C Concentraciones y volúmenes de reactivos utilizados para la PCR del intrón 1 Programa de amplificación del intrón 1, gen RET M Fotografía de un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio de los resultados de la amplificación del intrón 1. Fotografía del resultado de secuenciación de la región intrónica del gen RET. Electroferogramas del Homocigoto CC, Heterocigoto CT y Homocigoto TT

38 Análisis de datos – Frecuencia genotípica y alélica SNPPoblaciónGenotipo No. de individuos % Frecuencia Genotipica Frecuencia esperada Frecuencia alélica x2 HWE (p) Exón 2 Afectos G/G * ( ) G/A A/A Controles G/G (0.32) G/A A/A Exón 7 Afectos G/G (0.48) G/A A/A Controles G/G (0.499) G/A A/A Exón 15 Afectos C/C * ( ) C/G G/G Controles C/C (0.713) C/G G/G IVS Afectos C/C (0.483) T/C T/T Controles C/C (0.348) T/C T/T Análisis Hardy-Weinberg para los polimorfismos

39 Polimorfismo c135G>A χ2χ2 p Genotipo GGGAAA 12.54* Afectos2336 Controles15224 Polimorfismo c1296G>A Genotipo GGGAAA 20.21* Afectos25133 Controles62213 Polimorfismo c2712C>G Genotipo CCCGGG 20.44* Afectos3911 Controles21164 Polimorfismo IVS1+1813C>T Genotipo CCCTTT 8.35*0.015 Afectos Controles Análisis de datos – Chi cuadrado Valores calculados con 2 grados de libertad, *: significativo Análisis Chi cuadrado para los grupos estudiados y los genotipos observados de cada polimorfismo

40 PolimorfismoGenotipoAfectos N(%)Controles N(%)ORa95% ICbP c135G>A G/G2 (4.88)15 (36.59)1 G/A33 (80.49)22 (53.66) * A/A6 (14.63)4 (9.76) * G/A + A/A39 (95.12)26 (63.41) * c1296G>A G/G25 (60.98)6 (14.63)1 G/A13 (31.71)22 (53.66) * A/A3 (7.32)13 (31.71) * G/A + A/A16 (39.02)35 (85.37) * c2712C>G C/C39 (95.12)21 (51.22)1 C/G1 (2.44)16 (39.02) * G/G1 (2.44)4 (9.76) NS C/G + G/G2 (4.88)20 (48.78) * IVS C>T C/C3 (7.32)6 (14.63)1 T/C13 (31.71)23 (56.10)1, NS T/T25 (60.98)12 (29.27)4, NS T/C + T/T38 (92.68)35 (85.37)2, NS Análisis de datos – Odds Ratio Análisis de Odds Ratio (OR) de los cuatro polimorfismos estudiados en el Gen RET IC 95%: intervalo de confianza de 95%, NS: no significativo; *: Significativo, R : Referencia

41 Introducción Materiales y Métodos Resultados Conclusiones Recomendaciones

42 Conclusiones Se demostró la existencia de los polimorfismos en el gen RET c135G>A, c1296G>A y 2712C>G, mediante PCR-RFLP y el polimorfismo IVS1+1813C>T mediante la secuenciación; en una muestra de 82 individuos, (41 niños afectos con HSCR del HBO y 41 controles). Se constató la degradación del ADN proveniente de muestras parafinadas, pero a pesar de ello su calidad fue suficientemente buena como para brindar buenos resultados de PCR. Se determinaron las frecuencias genotípicas y alélicas de los cuatro SNPs en el gen RET. El valor χ 2 se puede asegurar que las frecuencias genotípicas y alélicas fueron similares entre los grupos control y afectos para los polimorfismos c1296G>A e IVS C>T. Pero los polimorfismos c135G>A y c2712C>G, las frecuencias genotípicas y alélicas fueron diferentes para el grupo control y afecto.

43 HWE de los polimorfismos c1296G>A e IVS C>T, mostraron resultados que confirman que la población en estudio estuvo en equilibrio y no fue afectada por fuerzas evolutivas externas, tales como mutación, consanguinidad, y selección natural. Los valores encontrados para los polimorfismos c135G>A y c2712C>G, permitieron conocer que el grupo control estaba en equilibrio, pero el grupo de afectos no, razón por la cual estos SNP se presume que están asociados con HSCR. El polimorfismo c135G>A tras las primeras pruebas estadísticas realizadas fueron confirmados por la prueba estadística de OR, se observa que un individuo portador del genotipo AA o el genotipo GA tiene un riesgo 11 veces mayor de padecer HSCR. Mientras que los OR de los polimorfismos c1296G>A y c2712C>G son menores a uno, por lo que parecen ser significativamente factores protectores de la enfermedad. Conclusiones

44 Introducción Materiales y Métodos Resultados Conclusiones Recomendaciones

45 En el caso de que haya continuidad del estudio: Seguir buscando mutaciones asociadas con este fenotipo, principalmente en el gen RET u otro gen que esté involucrado en el desarrollo del SNE. Ampliar el número de muestras. Relacionar los diferentes tipos de aganglionosis con la forma en que se presenta la enfermedad (esporádica o familiar) necesarios para una completa correlación fenotipo-genotipo. Incluir un análisis de haplotipos, con el fin de determinar si existe un locus de susceptibilidad, que cause la enfermedad.

46

47 Applied Biosystems. (2009). DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Applied Biosystems Chemistry Guide. Second Edition. pp 4-8. Beckman Coulter, Inc. (2009). AGENCOURT® AMPURE® XP PCR Purification Protocol v001. [En línea: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/bibliography?docname=Protocol_000387v001.pdf ] Briceño, L. (2002) Historia de la cirugía pediátrica. Gac Méd Caracas, 110(2): [En línea : &lng=es] Cochard, L. (2012). Netter's Atlas of Human Embryology. Saunders: 147. Heanue, T. & Pachnis, V. (2007). Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience 8: McPhee, J. & Hammer, G. (2010). Fisiopatología de la enfermedad. Una introducción a la medicina clínica. McGraw-Hill Interamericana Editores. Sexta edición. pp Passarge, E. (2002). Dissecting Hirschsprung disease. Nature genetics 31: Sánchez, A. (2010). Análisis de la base genética de la enfermedad de Hirschsprung y la displasia neuronal Intestinal tipo B, dos desórdenes del sistema Nervioso entérico. Sevilla. pp 19, 65. Tam, P. & Garcia, M. (2004). Molecular genetics of Hirschsprungs disease. Seminars in Pediatric Surgery 13: Bibliografía


Descargar ppt "ESTUDIO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL GEN RET COMO INDICADORES DE RIESGO PARA EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG EN NIÑOS ATENDIDOS."

Presentaciones similares


Anuncios Google