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Inmunoensayos Análisis forense Servicio Medico Legal Santiago,Chile Ethel Guerrero-Víctor Vidal.

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Presentación del tema: "Inmunoensayos Análisis forense Servicio Medico Legal Santiago,Chile Ethel Guerrero-Víctor Vidal."— Transcripción de la presentación:

1 Inmunoensayos Análisis forense Servicio Medico Legal Santiago,Chile Ethel Guerrero-Víctor Vidal

2 Test preliminares Basados en la exactitud de los hallazgos analíticos, un procedimiento analítico puede ser considerado preliminar o método concluyente. Los métodos de análisis preliminares son útiles para propósitos de screening

3 Test preliminares Los ejemplos típicos de la categoría de métodos preliminares donde no es necesaria la instrumentación son Test de color y los inmunoensayos de panel

4 Test preliminares Métodos preliminares que requieren instrumentación Radio inmunoensayo Enzimo inmunoensayo Fluorescencia polarizada Luminiscencia

5 El protocolo en el cual es usado un método preliminar, requiere de dos pasos cuando un resultado es positivo Los presuntivos positivos tiene que ser testeado para una droga especifica y sus metabolitos por cromatografía gaseosa /espectrometría de masas Solo esas drogas pueden ser reportadas como positivas

6 Valores de corte Si se utiliza un inapropiado valor de corte (cutoff) Si es adoptado un bajo nivel de corte, habrá un exceso de resultados negativos analizados por GC/MS Por el contrario si el cutoff es muy alto en el test preliminar, las muestras positivas pueden ser reportadas como negativa sin el proceso de GC/MS Causando al proceso de testeo de drogas una técnica ineficiente

7 ADULTERANTES La presencia de adulterante comunes y accesibles afectan la respuesta del común de los inmunoensayos. El efecto del adulterante varía con la categorías de las drogas testeada y la metodología de inmunoesayos usados Los adulterantes que causan interferencias significativas han sido revisada (1) 1.Cody J T, : Specimen adulteration in drug uranalysis ; forensic Sci Rew 2:63,90

8 Adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref amonio5,10% 5,10,14% 10% 14% RIA FPIA COC THC BAR THC - +/ /++ +++/+ 2 2,3 3 4 Hidróxido de potasio 0.5,5M 5M RIA FPIA THC +/ Bicarbonato de sodio 40mg/ml EMIT RIA BAR AMF, BAR THC + +/ sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

9 adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Blanqueador liq 12ul/ml 23UL/ML 24ul/ml 125ul 10% 5% 50% 5,10,50% EMIT RIA FPIA THC AMF BAR OP COC BEN THC OP AMF THC + - +/

10 adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Vanish1-10% 5% 10% RIA FPIA AMF,OP THC Detergent iónico 10% 10-5% 10% RIA FPIA COC THC BAR THC + +/ Vinagre125ul/ml 0.5gotas/ml 50% 10% EMIT RIA FPIA THC f

11 adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref SAL025% 50mgml 50mg/ml 75mg/ml 50mg/ml 10% 50mg/ml 10% EMIT THC OP,BAR AMF COC OPI THC BEN BAR A,BARCOP,THC THC BEN THC + +/- + -f

12 Adulterantes I sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Detergent e y jabón liq 1got/10mlEMITTHC+-f-f 7 1got/5mlEMITTHC+-f-f 7 10%RIATHC+/ %RIATHC %FPIATHC-++3,4 10%FPIABAR+/-++++4

13 Adulterante II cantidad método droga muestra efecto ref 12ul/mlEMITTHC ul/mlEMITBAR ul/mlEMITBEN %EMITTHC,BEN+/ %EMITBAR+++9 2%RIATHC,BEN+/ %FPIAANF,BAR,THC,BEN+/-+++9

14 sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Fosfato5%10% 10% RIA FPIA COC THC AMF BAR OP + +/ Etilen glicol20% RIA FPIA THC propanol20% 50% 20% 50% RIA FPIA THC + +/- + +/

15 adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Etanol20% RIA FPIA THC SANGRE 1gota/10ml 10% EMIT FPIA THC + +/ Ácido ascórbico 10% RIA FPIA AF OP THC f---f

16 adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Visine125ul/ml 107ul/ml 10% EMIT RIA FPIA THC BEN THC Agua oxigena da 6ul/ml EMIT RIA FPIA BEN THC BEN THC + +/

17 Adulterantes La mayoría de los estudios analizados no han comparado los efectos de los adulterantes bajo las mismas condiciones Dificulta hacer declaraciones generales concerniente a la robustez de una metodología sobre otra. Sin embargo los ensayos de marihuana son más susceptibles a los efectos de los adulterantes

18 Realidad Médico Legal En el departamento de laboratorios de Santiago se realizaron 6762 pericias toxicológicas de los cuales 33% de estas pericias, no es para determinar la causa de muerte, sino para entregar más elementos a la investigación 1007 corresponden a informes sobre consumo de drogas de abuso

19 Análisis toxicológico Grupo G1 tanatología Diagnóstico de muerte por arma blanca, arma de fuego, golpe contundente y atropello clínica y sexología forense pericias que corresponde a consumo de drogas de abuso, psiquiatría forense son sometidas a un rastreo de drogas de abuso incluyendo alcohol

20 Toma de decisión La Administración de Justicia necesita de respuestas oportunas debido a la gran cantidad de peritajes, se tomó la decisión de utilizar la técnica de inmunoanálisis, para el rastreo de drogas de abuso. por GC-MS considerada actualmente el gold standar de la técnicas confirmatorias.

21 INMUNOENSAYOS en la actualidad la mayoría de los laboratorios forenses realizan screening de drogas de abuso mediante técnicas de inmunoensayo debido que dichas técnicas presentan una elevada sensibilidad y son rápidas de usar (10)

22 Orina La orina es el fluido biológico preferido para el análisis de uso de drogas ilegales y sus metabolitos. Mientras la tendencia reciente ha sido aplicar tecnología de laboratorio a nuevos medios biológicos, debería tenerse en cuenta que el análisis de orina es una tecnología bien conocida en la que la mayoría de los problemas ha sido descubiertos y resueltos,o por lo menos, definido.

23 Orina La importante ventaja de la orina para los test de detección de drogas es que generalmente esta disponible en cantidad suficiente, es fácil de recoger y las drogas y sus metabolitos tienden a estar presente en concentraciones relativamente altas

24 Comparación de inmunoensayo y equivalencia Cada analito de los paneles fue evaluado en comparación entre panel EMIT R y CG/MS Todos los resultados fueron confirmados por CG/MS

25 Opiáceos PANELEMIT(+)EMIT(-)TOTAL (+)707 (-)17071 TOTAL % % % PANELCG/MS(+)CG/MS(-)TOTAL (+)707 (-)070 TOTAL 7 100% % %

26 Cocaína PANELCG/MS(+)CG/MS(-)TOTAL (+)29433 (-)067 TOTAL % % % PANELEMIT(+)EMIT(-)TOTAL (+)330 (-)16667 TOTAL 34 97% % %

27 Marihuana THC PANELEMIT(+)EMIT(-)TOTAL (+)320 (-)66369 TOTAL % % % PANELCG/MS(+)CG/MS(-)TOTAL (+)30232 (-)069 TOTAL % % %

28 ANFETAMINAS PANELEMIT(+)EMIT(-)TOTAL (+)250 (-)37073 TOTAL % % 98 97% PANELCG/MS(+)CG/MS(-)TOTAL (+)21425 (-)073 TOTAL % % 98 96%

29 METANFETAMINAS PANELCG/MS(+)CG/MS(-)TOTAL (+)141 (-)026 TOTAL14 100% 27 97% %

30 Cada método de screening tiene sus ventajas y desventajas Unos u otros pueden ser más económico bajo diferentes series de circunstancias Cada laboratorio tendrá que considerar esas circunstancias y elegir el método que le entregue el screening mas eficiente para un grupo de drogas en particular

31 SANGRE La sangre es considerada como la muestra más útil para la identificación de drogas en análisis cuantitativo. Dado que Las sustancias psicoactivas que se testean a menudo abandonan la sangre rápidamente esta es más útil para para la identificación del consumo reciente Generalmente los valores de están en la sangre en concentraciones bajas, típicamente en un rango de 5ng (10 -9 ) - 5 g(10 -6 )

32 sangre Existen diversos procedimientos de detección de drogas en sangre para las drogas que se abusa más frecuentemente La CL es una de las técnicas más empleadas, ya que es capaz de identificar al mismo tiempo diversos compuestos similares La GC-MS por si misma permite el análisis de sangre pero se debe realizar una derivatización para incrementar la sensibilidad

33 inmunoensayo Los inmunoensayo para las drogas de abuso están diseñados para la determinaciones en orina y en sangre, Es con la sangre con lo que la versatilidad y la sensibilidad del RIA y posteriormente del ELISA son particularmente ventajosa

34 Sangre En1978 se publicó la aplicación de inmunoensayo a un fluido distinto de la orina ( 10). desde esa fecha la comunidad toxicológica ha manifestado interés hacia la aplicación de los inmunoensayos a diversas muestras biológicas como; suero, sangre total, bilis, humor vítreo y tejidos (11) La extensión de los inmunoensayos a las muestras de sangre conlleva la modificación de los procedimientos utilizados en el análisis de orina, por lo que las muestra de sangre total no pueden ser analizadas de forma directa. Presentan altos niveles de absorbancia que interfieren con los medidas a realizar por los métodos inmunoenzimaticos, por lo que es necesario una preparación de la muestra antes de someterla al análisis(12)

35 sangre Durante estos últimos meses en nuestro Laboratorio ha estado desarrollando un método para detectar presencia de de drogas de abuso en sangre mediante la aplicación de técnica de inmunoensayo

36 DROGAS DE ABUSO ESTUDIADAS DROGACut-off (ng/mL) Conc. Terap. (ng/mL) LD a pH 9 (ng/mL) LD a pH 11 (ng/mL) ANFETAMINA NEG(1050)230 BENZOILECG30044*20 OXAZEPAM300230* NORTRIPTIL FENOBARBIT METAMFET NEG (1020)968 MORFINA METADONA MDMA * COCAINA300350NEG(1200)

37 referencia 11.Vogel J, Hednett CN;Detection of drugs in blood, bile and tssues with an enzyme inmunoassay technique, J Anal Toxicol,:5; ;81 12.Lillsunde P, Michenson L, ForsstronT, KurteT SchultzE, Ariniemi K.. Comprehensive drug screening in blood for detecting abused drugs or drug potencially hazardous for traffic safety. Forensic Scien Innt,77, Screenig de drogas de abuso en sangre total mediante inmunoesayo enzimático CEDIA originalmente diseñados para el análisis de orina.aplicación en caso forense.R Garcia E Moreno T Soriano

38 referencias 2. Cody JT Schawarzhopff R:Impact of adulterants on RIA analysis of urine for drugs of abuse; J Anal. Toxicol13:277;89 3. Bronner W,Nyman P.,von Minden D.Dectectability of phencyandclidine 11-nor- 9 -tetrahidrocannabinol-9-carboxylic acid in adulteratedurineby radioinmunoassay and flurescence polarization inmunoassay; J Anal Toxicol 14:368;90 4. Schawarzhopff R, Cody JT; the effects of adulterrants agents on FPIAanalysisof urine drugs of abuse: J Anal Toxicol 17:14;93 5. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89 6. MIKKELSEN s l,Ash KO: Adulterants causingfalse negative in ilicite drugs testing: Clin Chem:34:2333;88 7. Schwarts R H, Hayden GF, RiddileM:Laboratory detection marijuana use ;Am J D iseases of Children 139:1093;85 8. Kim HJ,Cerceo E: Interference by NaCl with the Emit method od f analysis for drugs of abuse; Clin Chem: 22:1935,76 9. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89 10 iwerse-Bergman A, Schomolldt: Direct semiquantitative screening of drugs of abuse in serum and whole blood by means of CEDIA DAU urine inmunoassays; J Anal Toxicol, 23; :99


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