GENES que CONTROLAN el CICLO CELULAR en EUCARIOTAS

Presentación del tema: "GENES que CONTROLAN el CICLO CELULAR en EUCARIOTAS"— Transcripción de la presentación:

1 GENES que CONTROLAN el CICLO CELULAR en EUCARIOTAS
Presentación powerpoint original: gentileza de la Dra. Vanesa Gottifredi (FIL)

2 2001. Año del ciclo celular Premios Nobel 2001 de Fisiología y Medicina Leland Hartwell (1939). Fred Hutchinson Cancer Research Council, Seattle, USA Paul Nurse (1949). Imperial Cancer Research Foundation (ICRF), London, UK Timothy Hunt (1943) ICRF, London, UK

3 ¿Es tan simple realmente?
simétrica en general, excepto en S. cereviciae, que es por gemación (división asimétrica: una célula hija más grande y otra más pequeña)

4 El ciclo celular Características fundamentales: Altamente Ordenado
Finamente regulado Funciona un número finito de veces en una población celular en división; Después: senescencia y apoptosis Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

5 ¿Cuánto tiempo dura el ciclo celular?
Preguntas frecuentes ¿Cuánto tiempo dura el ciclo celular? ¿Se puede medir el tiempo que dura cada etapa? ¿Se puede saber cuál de las etapas están atravesando las células? ¿qué señales inducen la división celular?

6 Cálculos (pioneros) de la duración del ciclo celular entero
La duración del ciclo celular varía de acuerdo al entorno en el que se encuentra un tipo celular determinado a expensas de la duración de las distintas fases, excepto M, que es bastante constante = aprox 1 hora. ejemplo: para medir la duración del ciclo celular de los hepatocitos que forman parte del hígado de un ratón adulto, se prepararon cortes y se los tiñó con un colorante para que las células en mitosis resultaron fácilmente reconocibles al microscopio. Habiendo observado células en total, se encontraron solamente 3 células en mitosis (índice mitótico). duración del ciclo celular (x) de los hepatocitos en el hígado de un ratón adulto: 1 hora /x = 3 /25000 x = 1 año

7 Cálculos (pioneros) de la duración de las fases del ciclo celular
En otro experimento, los hepatocitos fueron disgregados y puestos en condiciones de cultivo (asincrónico). En un momento se agregó timidina radioactiva (no pulso) y a distintos tiempos, se separaron alícuotas para: 1) contar las células totales (Fig 1) 2) fijar, teñir las células y prepararlas para radioautografía, sobre la cual se hicieron dos tipos de análisis: conteo de células en mitosis radioactivas (Fig 2A) medición de la intensidad de las señales radioactivas (número promedio de granos de plata) sobre las células mitóticas (Fig 2B)

8 Cálculos (pioneros) de la duración de las fases del ciclo celular (cont.)
Fig. 2 primeras mitosis marcadas provienen de cél que estaban saliendo de S cuando se agregó la marca G2 = 3hs el comienzo del plateau se debe a cél que recién entraban a S cuando se agregó la marca Fig. 1 Curva de crecimiento en medio líquido Se mide el tiempo de duplicación de la población celular. Aquí: aprox = 20 hs S = 7 hs las q estaban en G1 cuando se agregó la marca no van a adquirir más marca q las q estaban entrando a S; de ahí el plateau G1 = 20 – (3 + 7) = 10 hs

9 Factores de crecimiento
todo empieza con…… Factores de crecimiento Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

10 algunos actores moleculares que promueven el ciclo
algunas reacciones duran miliseg; otras, seg esto es un ejemplo de lo que se llama “transducción de señales” = secuencias (cascadas) de reacciones bioquímicas que convierten el estímulo (señal) externo en un fenotipo celular evidente p. ej. división celular

11 pero como ven, hay muchas vías de transducción…

12 El ciclo “se arresta” (G0) debido a una de tres situaciones:
contacto cél-cél (quiescencia) ayuno (quiescencia) linaje celular viejo (senescencia; irreversible → apoptosis) una de las vías, como ejemplo actores moleculares en el núcleo “loop” regulatorio

13 En el núcleo, las ciclinas se unen a kinasas llamadas CDKs
(cyclin-dependent kinases) y las activan. Son su subunidad regulatoria K la unión a ciclinas facilita fosforilaciones activadoras de CDKs en algunas posiciones aminoácidicas por parte de otras kinasas otro mecanismo de activación es la defosforilación de CDKs en algunas posiciones aminoácidicas por parte de fosfatasas (ej. cdc25) Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

14 hay cdks y ciclinas específicas para cada etapa del ciclo celular
4 D cada kinasa es activada por una ciclina específica Las CDKs son reguladores positivos del ciclo Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

15 las ciclinas se degradan cuando ya no se necesitan
El complejo ciclina B/Cdk1 se denomina  Factor promotor de la mitosis (MPF). las ciclinas se degradan cuando ya no se necesitan en la etapa correspondiente del ciclo celular = ciclina B Cdk1 cdk1 cdk4 ciclina E = ciclina D cdk2 Ratones KO en genes de ciclinas tienen problemas neurológicos Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

16 Las ciclinas oscilan (“ciclan”) durante el ciclo celular;
se degradan en el proteasoma (cyclin B) A Westerns: (fase S) (fase M) Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

17 Por lo tanto, las cdks se vuelven inactivas al final de cada fase → promueve la progresión a la siguiente fase del ciclo La degradación proteasoma-dependiente de cyclin B determina (indirectamente) la direccionalidad de la transición M → G1

18 grupo de Gorbsky, Nature 2006
si se inhibe artificialmente la degradación de ciclina B (con inhibidor de proteasoma o versión no-degradable de ciclina B) la progresión de M → G1 se torna reversible !!! grupo de Gorbsky, Nature 2006 ciclina B o inh. proteasoma células Hela ↓

19 Checkpoints Pregunta Decisión: seguir o detenerse
= momentos del ciclo en los que ocurre control de calidad y decisión del futuro (seguir ciclando o detenerse) Pregunta Decisión: seguir o detenerse pasado el checkpoint, la progresión del ciclo es irreversible no hay vuelta atrás ¿El DNA está intacto?: Si no lo está, las señales de daño hacen arrestar el ciclo para su reparación Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

20 Los CKIs son reguladores negativos del ciclo celular
Inhibidores de CDKs (CKIs): proteínas que disminuyen la velocidad el ciclo Cdk1= Los CKIs son reguladores negativos del ciclo celular

21 Existen dos tipos de inhibidores de kinasas
dependientes de ciclinas (CKIs)

22 Regulación positiva Regulación negativa
(citokina)

23 Hay GFs que tienen rol dual
P. ej.TGF-β (transforming o tumor growth factor): ¿ángel o demonio? TGF-β es un importante inhibidor del crecimiento e inductor de apoptosis en un gran número de tipos celulares. Muchos tumores se vuelven refractarios a sus efectos supresores debido, fundamentalmente, a defectos en vías de señalización intracelular. En esta situación, el TGF-β contribuye a la progresión tumoral (de ahí su nombre) por motivos ajenos al ciclo celular: estimula la migración/invasividad celular, induce angiogénesis y suprime el sistema inmune. 

24 Rb: otro importante regulador negativo,
un alelo mutado somáticamente en casos de retinoblastoma (el otro heredado germinalmente) E2F libre Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

25 mirando en detalle, Rb siempre está fosforilada.
Está inactiva como secuestradora (de E2F) cuando está moderadamente fosforilada E2F libre Los mamíferos tenemos dos genes parálogos de Rb: p107 y p130. Por lo tanto, fenotipos visibles (tumores) en ratones KO son evidentes en triples KO

26 CDK2/ ciclina E RB E2F CDK2/ ciclina E E2F (libre)
Resumiendo: las CDKs son reguladores positivos del ciclo algunas lo son porque indirectamente liberan a E2F, que es un regulador positivo CDK2/ ciclina E RB E2F (CDK2 inhibe a Rb …..como secuestrador) (Rb secuestra a E2F) simplificando…. CDK2/ ciclina E E2F (libre)

27 Múltilples genes target de E2F (conocidos mediante ChIP)
genes que codifican a proteínas del Origin Recognition Complex (ORC), requisito para replicación de DNA en fase S Myc (regulador positivo = oncogen) ciclina E (ayuda a CDK2 en fosforilar a Rb) ARF (inhibe a MDM2, que degrada a p53) Además, genes implicados en otras fases del ciclo: DNA damage checkpoint and repair pathways chromatin assembly/condensation chromosome segregation, mitotic spindle checkpoint apoptosis differentiation.

28 Resumen hasta aquí: Durante un ciclo celular, el balance de la actividad de reguladores positivos y negativos son responsables de la salida de una fase y entrada a la siguiente. Positivos: CDKs-ciclinas; E2F Negativos: CKIs (que inhiben actividad de CDKs); Rb Rb inhibe la actividad transcripcional de E2F. La fosforilación de Rb por CDK2 produce la liberación de E2F. Si el balance es positivo para actividad de CDK2 y para actividad de E2F, la célula entra en fase S y cicla.

29 Otro importante regulador negativo: p53
Homotetrámero*, Factor de Transcripción activador… de genes reguladores negativos del ciclo R248 R273 R175 domains: R249 G245 R282 Activation Basic DNA-binding domain arginine-rich Tetramerization *1 sola subunidad mutada → tetrámero no funcional: mutación dominante negativa

30 P53 es un factor transcripcional clave para el ciclo celular
en plantas, el equivalente funcional es una proteína con otra secuencia de aa llamada HOG1 p53 Apoptosis Growth arrest Prevention of blood vessel formation P21, miR-34, GADD45, s Scotin,Fas, Bax, PERP Pig3, Killer/DR5,AIP1, Noxa, Sepuku TSP1, BAl1, Maspin, GD-AIF

31 freno principal del ciclo
MDM2 destruye el freno freno principal del ciclo

32 DNA breaks ATM ATR E2F ARF*(P14 humanos; p53 MDM2 El daño en el DNA
provoca el arresto del ciclo vía fosforilación de p53 (→ su forma activa) mecanismo de resguardo contra proliferación excesiva DNA breaks ATM ATR E2F ARF*(P14 humanos; p19 ratón) acá es reg. neg. ayuda a p53 (otra kinasa) (una kinasa) interactúa con (inhibiendo) p53 MDM2 fosforilada *ARF además se une a E2F, promoviendo su degradación en proteasoma (Rizos et al., Cell Cycle, julio 2007)

33 Li-Fraumeni Syndrome (LFS; OMIM #151623) is an autosomal dominant cancer predisposition syndrome characterized by early onset tumors including sarcomas, breast cancer, leukemia, brain tumors, and adrenocortical carcinoma. Li-Fraumeni syndrome is primarily attributed to germline mutations in the p53 tumor suppressor gene, In addition to germline p53 mutations, the p53 gene is the most commonly mutated gene in human cancers, with as much as 50% of tumors containing somatic p53 mutations. Cancer Res Oct 15;63(20):

34 cross-talk between Rb and p53 pathways:
dos paradigmáticos supresores de tumores CDK2 |←←←↑ Ciclina E ↑ p21 | Modified from Exp Cell Res 2001 Mar 10;264(1):56-66

35 Resumen de p53: P53 es un factor transcripcional que puede inducir arresto del ciclo celular o eventualmente muerte celular programada actuando como guardián del genoma (evita la inestabilidad genómica). P53 está mutada en 50% de los casos de cáncer (germinal y somáticamente). Uno de los blancos transcripcionales de p53 es MDM2. Esta proteína es una E3 ligasa de ubiquitina para la degradacion de p53 en el proteosoma. Por lo tanto, este feedback negativo regula los niveles de p53. Otro blanco transcripcional de p53 es p21, lo que explica su capacidad de arrestar el ciclo celular en G1 Otro blanco transcripcional de p53 es miR-34, un microRNA que degrada el mRNA CDK2 (paper de seminario) La actividad de p53 activa (fosforilada) aumenta como consecuencia de la aparición de señales de daño en ADN

36 ¿en qué fase del ciclo están las células en un cultivo (asincrónico)?
FACS (Fluorescent activated cell sorter) se suele usar colorante fluorescente para DNA, p. ej. DAPI: Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

37 ¿en qué fase del ciclo están las células?
Go/G1 G2,M Análisis estático FACS S 2n 4n Análisis dinámico para ver si las células están vivas y ciclando: agregarles un pulso de BrDU: las que están atravesando S se verán rojas al fijar y revelar. Si ciclaron, después de unas horas se verán rojas las que están en G2, M y G1 (antes estuvieron en S)

38 Señales de daño en DNA

39 visibles al microscopio mediante anticuerpos
tambn fosforila a CHK1 y CHK2 complejo sensor del daño plataforma recombinasa exonuecleasa realiza HR focos de daño visibles al microscopio mediante anticuerpos punta de DNA desnudo a ser reparado BRCA ayuda en NHEJ y en splicing de genes de reparación (Savage et al Mol Cell 2014) Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. van Attikum & Gasser 2009

40 por una vía dependiente y otra independiente de p53
pero tambien: el daño severo en el DNA (SSBs y DSBs) hacen frenar el ciclo en G1 y G2 (para su reparación por maquinarias reclutadas por el complejo sensor MRN) por una vía dependiente y otra independiente de p53 E2F queda secuestrado por Rb vía indep. de p53 (freno accesorio) fosforilada queda inactiva y no puede fosforilar a Rb principalmente Chk1 fosfatasa de Cdk2 (fosforilada se degrada y no puede activarla) vía dep. de p53 (freno principal) E2F queda secuestrado por Rb inactiva no puede fosforilar a Rb FEBS Lett 2001 Feb 16;490(3):117-22

41 p53 protagonista detalles de sus sitios de fosforilación G1 and G2
Los blancos de p53 son p21 y miR-34 (→arresto en G1 y G2), (y Gadd45 y (en G2)) para facilitar la reparación del daño se muestran sus sitios fosforilados G1 and G2 →eventualmente Genes Dev 2001 Sep 1;15(17):

42 Mutaciones en genes del ciclo celular
implicadas en enfermedades humanas * SENSORS and EFFECTORS MEDIATORS * ataxia = incoordinación de movimientos (cerebelo) telangiectasia = malformaciones arterio-venosas→ hemorragias

43 Racionalidad de la radioterapia
anti-tumoral (en células KO artificialmente sin el freno p53) La radiación en dosis moderadas mata a células deficientes en p53, que no pueden arrestar eficientemente en G1 o G2: mitosis “catastrófica” (imposibilidad de citokinesis debido al daño de DNA) KO de p53 Southern KO FACS irradiadas irradiadas WT Las células que tienen p53 se arrestan en G1 y G2,reparando el daño, mientras que las p53-/- entran en una mitosis abortiva que finalmente las destruye (observar por FACS degradación de DNA a 72 hs). Las drogas inhibidoras de CHK1 (junto con agentes que dañan el DNA) ayudan en los tratamientos anti-cáncer p53-/- aprovechando este principio, porque impiden totalmente el arresto por la vía independiente de p53, forzándolas a entrar en mitosis catastrófica, no afectando a las normales que pueden usar CHK2 para fosforilar a p53 ↓ ___ Science (1998) 282(5393):

44 Conclusión del trabajo anterior
Although p53 mutations provide cells with a selective growth advantage, such mutations burden them with a significant G1 or G2 checkpoint deficit; they cannot respond normally to DNA-damaging agents and enter mitosis and subsequently replicate their genomes in the presence of DNA damage, with failure of cytokinesis (analogía con auto sin frenos como para poder detenerlo en el taller y así reparar otros serios defectos; el auto choca). Such checkpoint defects may be exploited to treat the many cancers with abnormalities of p53 function.

45 Resumen de respuesta de los controladores del ciclo celular al daño en DNA:
El daño al ADN produce una inmediata respuesta celular como consecuencia de la activación de kinasas sensoras de SSBs y DSBs (DNA con extremos desnudos), que fosforilan a ATM y ATR: Como consecuencia, H2A-X en la región de daño queda fosforilada (en Ser139), que recluta a muchas proteínas,formando “focos” de daño, entre ellas HATs y recombinasas de la familia Rad, que van a facilitar la reparación una vez que el ciclo esté arrestado. Los focos rápidamente activan a CHK1 y CHK2, las cuales fosforilan a p53 y a la fosfatasa cdc25 (vía indep. de p53), arrestando el ciclo en los checkpoint de G1, S y G2. La fosforilación de p53 la libera de su degradador MDM2. Por lo tanto, p53 se acumula y también aumentan los niveles de las proteínas de sus blancos transcripcionales, p. ej. p21 (y otros como GADD45, , y miR-34), que anulan la actividad de ciclinas B, D y E → Rb queda secuestrando a E2F ocasionando arresto en G1 y G2.

46 Célular y ciclo celular modelo muy estudiado: músculo
Relación entre Diferenciación Célular y ciclo celular modelo muy estudiado: músculo

47 Las células diferenciadas no ciclan
células musculares Mol Biol Cell 1998 Jun;9(6):

48 Mesodermal progenitor
Upstream activators Mesodermal progenitor Determination MyoD/Myf5 Myoblast Differentiation Myogenin Maturation Myotubes MRF4 Myofiber genes Myofiber

49 El proceso de diferenciación celular consiste
en una coordinada sucesión de eventos moleculares Northerns: GM= growing medium DM = differentiation medium (actividad ) Marcadores del ciclo celular Marcadores de la diferenciación muscular Modified from Mol Biol Cell 1998 Jun;9(6):

50 regulador negativo del ciclo
MyoD promueve la transcripción de p21, regulador negativo del ciclo

51 (c-Abl es un gen pro-apoptótico)
Dev Cell 2002 Dec;3(6):757-8

52 Las células a diferenciarse pasan por un checkpoint de G1 y después por uno de diferenciación, que consiste en la activación de un “master gene” que le da la potencialidad a la célula de convertirse en una célula diferenciada (p ej stem cell de tejido) . La activación del “master gene” produce una salida irreversible del ciclo celular (Go) y la expresión de marcadores específicos de diferenciación que le cambian la morfología a la célula y la convierten en diferenciada. Las células terminalmente diferenciadas no ciclan (con pocas excepciones). El daño severo al ADN puede,a través de una señal cAbl-dependiente, regular negativamente la actividad del “master gene” MyoD, evitando así que células con mutaciones masivas diferencien y formen tejidos (Nat. Genet. [2002] 10: 1038)