Instituto Tecnológico de Tepic

Presentación del tema: "Instituto Tecnológico de Tepic"— Transcripción de la presentación:

1 Instituto Tecnológico de Tepic
Replicación del ADN

2 Contenido 1.- Introducción. 2.- El replicón. 3.- Replicación del ADN
> ADN Polimerasas. > Tipos de reacción de cebado. > Síntesis de ADN. > Síntesis de Fragmentos de Okasaki. > Síntesis de cadena lider y retrasada. > Modelo estructural de la ADN polimerasa III. > Unión de la ADN polimerasa III al ADN. > Bloqueo de la replicación del ADN. 4.- Aparato de replicación de bacteriofagos (fago T4).

3 Introducción Bien tenga la celula un solo cromosoma (como los procariontes) o muchos cromosomas (como en los eucariontes), la totalidad del genoma se debe replicar exactamente una vez en cada división celular. La iniciación de la replicación del ADN dirige a la celula (procarionte o eucarionte) a una división posterior. Si se lleva a cabo la replicación, no se puede permitir que se produzca la subsiguiente división hasta que el fenomeno de replicación se haya completado.

4 Introducción La unidad del ADN en la que se produce un acto individual de replicación se llama replicón. Cada replicón se “dispara” una vez, y sólo una, en cada ciclo celular, posee los elemetos de control necesarios para la replicación. Tiene un origen en el que se inicia la replicación y tiene un final en el que la replicación se detiene. El origen es un punto de acción en Cis, capaz de afectar solamente a aquella molécula de ADN en la que reside.

5 Introducción En una célula procarióntica, un genoma consta de un replicón, la iniciación en un único origen promueve la replicación de todo el genoma, una vez en cada división celular, de tal manera que esta forma de control de replicación se llama de copia única. Las bacterias pueden contener información genética adicional en forma de plásmidos. Un plásmido es un genoma de ADN circular autónomo que constituye un replicón separado. Un replicón plasmídico puede replicarse con el genoma bacteriano (mostrando un control de copia única) o puede estar bajo un control de clase diferente.

6 Introducción Cuando el número de copias de un plásmido es superior al del cromosoma bacteriano, se dice que se replica bajo un control multicopia. Cada fago o virus de ADN constituye también un replicón, capaz de iniciar muchas veces durante un ciclo infeccioso. De lo anterior se observa que la mejor forma de ver el replicón procarionte es definiendolo como: Cualquier molécula de ADN que contiene un origen y se puede replicar de forma autónoma en la célula. Aún así, cada uno de estos replicones debe activarse no mas de una vez en el ciclo celular.

7 Orígen del replicón En el ADN replicante, la región que se replica aparece como “ojo” dentro del ADN no replicado. El punto en el que se esta llevando la replicación se llama orquilla de replicación (o punto de crecimiento) Una orquilla de replicación se mueve de forma secuencial a lo largo del ADN, desde su punto de comienzo en el origen.

8 Orígen del replicón La replicación puede ser Unidireccional
o Bidireccional. La clase de fenómeno esta determinado según partan del orígen uno mas orquillas de replicación.

9 Orígen del replicón Cuando el replicón es circular, la presencia de un ojo forma la estructura  (teta).

10 Replicación del ADN La replicación del ADN es una tarea compleja que afecta a un conglomerado de actividades enzimáticas. Existen diferentes actividades que participan en las fases de iniciación, elongación y terminación en la replicación del ADN. La iniciación comprende el reconocimiento de un origen por un complejo de proteinas. Antes de que comience la síntesis de ADN, las cadenas progenitoras deben separarse y estabilizarse en el estado de cadena unica. Entonces se puede iniciar la sintesis de cadenas hijas en la horquilla de replicación. El acto de iniciar la síntesis de una cadena de ADN lo consigue un complejo de proteinas llamado en E. coli el Primosoma

11 Replicación del ADN Al final del replicón, son necesarias las reacciones de unión y/o terminación. Despues de la terminación, los cromosomas duplicados deben separarse uno de otro, lo cual necesita una manipulación de la estructura de orden superior del ADN. La elongación la lleva a cabo otro complejo de proteinas. El Replisoma que existe solamente como un complejo proteico asociado con la estructura particular que adopta el ADN en la Horquilla de replicación. No existe como unidad independiente. Conforme el riplosoma se mueva a lo largo del ADN, las cadenas parentales se desenrrollan y se sintetizan las cadenas hijas.

12 ADN Polimerasas Una enzima que puede sintetizar una nueva cadena de ADN a partir de una cadena molde se llama ADN polimerasa. Tanto células eucariónticas como procariónticas contiene multiples actividades de ADN polimerasa. Solo algunas de estas enzimas realizan verdaderamente la replicación, las otras participan en funciones auxiliares de la replicación y/o participación de la síntesis “ de reparación “ del ADN para sustituir secuencias dañadas.

13 ADN Polimerasas Se han identificado 3 enzimas ADN polimerasas en E. coli. La ADN polimerasa I : Participa en la reparación del ADN dañado, y en una función subsidiaria, en la replicación semiconservativa. La ADN polimerasa II : Participa en las reparaciones del ADN. La ADN polimerasa III: Es la polimerasa responsable de la sintesis de nuevas cadenas de ADN. Cuando se analizan extractos de E. coli en cuanto a su capacidad de sintetizar ADN, la actividad enzimatica predominante es de ADN polimerasa I. Su actividad es tan grande que hace imposible detectar las actividades de las enzimas realmente responsables de la replicación del ADN.

14 ADN Polimerasas Todas las ADN polimerasas eucariónticas y procariónicas comparten el mismo tipo fundamental de actividad sintética. Todas pueden extender una cadena de ADN añadiendo nucleótidos uno por uno a un extremo 3’-OH. La elección del nucleotido que se debe añadir a la cadena esta dictada por el apareamiento de bases con la cadena molde.

15 ADN Polimerasas La presición de la traducción se basa en la especificidad del apareamiento de bases. Aún así podemos esperar que se produzcan errores con una frecuencia de unos ~10-3 por cada par de bases que se replica. Es decir se espera un error por cada 1,000 pares de base que se replican. La tasa verdadera en las bacterias parece ser de unos ~ ~10-10. Es decir un error por cada 100,000,000 – 10,000,000,000 pares de bases. Que corresponde a aproximadamente a un error por cada genoma por cada mil ciclos de replicación bacteriana.

16 ADN Polimerasas Podemos dividir los errores que hacen las ADN polimerasas durante la replicación en dos clases: Error por sustitucion: Cuando se incorpora un nucleotido erroneo (aqui el nivel de error está determinado por la eficacia de la corrección de pruebas). Error por saltos (o desplazamientos) de fase: cuando se inserta u omite un nucleotido.

17 ADN Polimerasas La ADN polimerasa podría mejorar la especificidad de la selección de bases complementarias en una (o ambas) de dos fases: Podría analizar a la base que entra en cuanto a una adecuada complementareidad con la base molde; por ejemplo reconociendo de forma especifica caracteristicas químicas adecuadas. Esto seria un control de error Presintetico. O podría analizar el par de bases despúes de que se haya añadido a la cadena de nueva base, y, en aquellos casos en los que se hubiera hecho un error, eliminar la base que se añadio mas recientemente. Esto seria un control de corrección.

18 Todas las enzimas bacterianas poseen una actividad 3’ – 5’ que se lleva a cabo en dirección inversa a la de síntesis de ADN. Esto proporciona la función de corrección.

19 ADN Polimerasas La primera enzima que se identificó fue la ADN polimerasa I que es un unico polipeptido de 103 kDa, el cual se puede romper en dos regiones por un tratamiento proteolitico. El producto de ruptura de mayor tamaño (68 kDa) se llama fragmento de Klenow y se utiliza en reacciónes sinteticas in vitro, contiene las actividades de polimerasa y de 3’ – 5’ exonucleasa, sus puntos activos estan separados unos ~30 Å indicando que existe una separación espacial entre añadir una base y eliminarla. El fragmento pequeño (35 kDa) posee una actividad 5’ – 3’ exonucleolitica, que elimina pequeños grupos de nucleótidos, hasta unas 10 bases cada vez. Esto proporciona a la ADN polimerasa una capacidad unica de comenzar la replicación in vitro en una melladura de ADN

20 ADN Polimerasas En un punto donde se ha roto una unión fosfodiester en una ADN de cadena doble , la enzima extiende el extremo 3’ – OH. Según se sintetiza el nuevo segmento de ADN, desplaza en el dúplex a la cadena homóloga ya existente.

21 ADN Polimerasas La ADN polimerasa III es un gran complejo enzimatico, posee una subunidad  de 130 (kDa) que posee la actividad sintetica de ADN y otra subunidad  que posee la actividad correctora exonucleolitica 3’ – 5’, las dos subunidades funcionan en conjunto para aumentar la corrección de errores. Una caracteristica común de las ADN polimerasas es que no pueden iniciar la sintesis de una cadena de ADN a partir de nucleótidos libres. Necesitan un cebador para proporcionar un extremo libre de 3’ – OH que se pueda extender añadiendo nucleotidos.

22 Tipos de reacción de cebado

23 Tipos de reacción de cebado
Se sintetiza una secuencia de ARN sobre la plantilla o molde, de forma que el extremo 3’ – OH libre de la cadena de ARN se extiende por la reacción de la ADN polimerasa.

24 Tipos de reacción de cebado
Se genera un extremo cebador dentro del ADN duplex. El mecanismo mas habitual es la introducción de una melladura. En este caso, la cadena preexistente es desplazada por la que se ha sintetizado.

25 Tipos de reacción de cebado
Una proteína ceba la reacción de forma directa presentando un nucleótido a la ADN polimerasa

26 Síntesis de ADN La estructura antiparalela de las dos cadenas de ADN dúplex supone un problema para la replicación. Según avanza la horquilla de replicación, las cadenas hijas deben de replicarse en las dos cadenas simples parentales expuestas. La horquilla se mueve en la dirección 5’ – 3’ en una cadena y en la dirección desde 3’ – 5’ en la otra cadena. Pero los ácidos nucleicos solo se sintetizan desde un extremo 5’ hacia un extremo 3’. El problema se resuleve sintetizando la cadena que crece globalmente desde 3’ a 5’ en una serie de fragmentos cortos .

27 Síntesis de ADN

28 Síntesis de Fragmentos de Okazaki
La primasa sintetiza ARN (ARN polimerasa) La DNA polimerasa III extiende el ARN cebador dentro del fragmento de Okazaki. Se sintetiza el siguiente fragmento de Okazaki. La ADN polimerasa I utiliza traslación de melladuras para remplazar el ARN cebador por ADN. La ligasa sella la melladura.

29 Sellado de melladuras por la ADN ligasa.

30 Síntesis de Fragmentos de Okazaki
Los fragmentos de Okazaki se encuentran en el ADN que se replica tanto en los procariontes como en los eucariontes. La transición da como resultado la formación de uniones covalentes entre los fragmentos de Okazaki. La cadena conductora (lider) se sintetiza de manera continua sin embargo puede presentar roturas (que no son fragmentos de Okazaki) originados por la incorporación de un Uracilo al ADN en vez de Timina, cuando el Uracilo es eliminado por un proceso de reparación, la cadena conductora tiene roturas hasta que se incerta Timina. Así la cadena retrasada se sintetiza de manera discontinua y la cadena conductora se sintetiza de manera continua . A esto se le llama replicación semidiscontinua.

31 Síntesis de cadenas conductora y retrasada
Se necesitan dos tipos de funciones para convertir el ADN de cadena doble al estado de cadena sencilla: Una helicasa es una enzima que separa las cadenas de ADN, utilizando por lo general la hidrólisis del ATP. Tipicamente se hidrolizan de 1-2 ATPs por cada par de bases que se desenreda. Una proteina de unión a cadena sencilla (SSB) se une al ADN de cadena sencilla impidiendo que vuelva a retomar el estado dúplex.

32 Síntesis de cadenas conductora y retrasada
La conversión de ADN de cadena doble de X174 en una cadena unica individual ilustra las caracteristicas del proceso. La proteina A del fago mella la cadena viral (+) en el origen de replicación. En presencia de dos proteinas huesped, Rep y SSB, asi como ATP , se desenrolla el ADN mellado. La proteina Rep proporciona una helicasa que separa las cadenas; la SSB las atrapa en una forma de cadena sencilla.

33 Síntesis de cadenas conductora y retrasada

34 Modelo Estructural de las subunidades de la ADN polimerasa III
La holoenzima es un complejo (90 kDa) que contiene diferentes componentes: Un centro catalitico; incluyendo la subunidad . Un componente de dimerización  que une dos nucleos. Un componente de procesividad  que mantiene la polimeraza sobre el ADN. Y Un cargador Tenaza  que coloca las subunidades de procesividad en el ADN.

35 Modelo Estructural de las subunidades de la ADN polimerasa III
Un dimero  y un complejo  reconocen la plantilla cebador para formar un complejo de preiniciación, en esta reacción el complejo  rompe el ATP y transfiere la subunidad  a la plantilla cebada

36 Modelo Estructural de las subunidades de la ADN polimerasa III
El nucleo enzimatico contiene subunidades ,  y    

37 Modelo Estructural de las subunidades de la ADN polimerasa III
Un dimero  se une al nucleo de la polimerasa, proporciona una función de dimerización que une un segundo núcleo de polimerasa.      

38 Modelo Estructural de las subunidades de la ADN polimerasa III
 se une fuertemente al ADN , pero se puede deslizar a lo largo de una cadena dúplex, el dimero circunda al dúplex proporcionando la “ tenaza deslizante “ que permite que la holoenzima se deslice a lo largo del ADN.

39 Bloqueo de la replicación
Se han identificado secuencias que detienen el movimiento de las horquillas de replicación en la forma de los elementos ter del cromosoma de E. coli., así como secuencias equivalentes en algunos fagos. La caracteristica común de estos elementos es una secuencia concenso de 23 pb que proporciona el punto de unión para el producto del gen tus, una proteina de 36 kDa que es necesaria para la terminación. Tus se une a la secuencia concenso, donde proporciona una actividad contra-helicasa y hace que la DnaB deje de desenrollar el ADN. El resultado de esta inhibición es detener el movimiento de la horquilla de replicación y presumiblemente dar lugar al desensamblaje del aparato de replicación.

40 Unión de la ADN polimerasa con el ADN
La DnaB desenrrolla la cadena. La DnaG contacta las subunidades  de la ADN polimerasa. v

41 Bloqueo de la replicación
El produto del gen Tus es una proteina que es necesaria para la terminación de la replicación, se une a la secuendia donde proporciona una activida contra – helicasa y hace que la DnaB deje de desenrrollar el ADN

42 El aparato de replicación del fago T4
Cuando el fago T4 invade una celula de E. coli proporcionan varias funciones propias que bien sustituyen o aumentan las funciones del huesped. La degradación del ADN del huesped es importante para liberar nucleotidos que se reutilizan en la sinstesis del ADN del fago. El ADN del fago es diferente a la del huesped porque utiliza hidroximetilcitosina en vez de la citosina habitual. La síntesis del ADN del T4 esta catalizada por un agregado multienzimático ensamblado a partir de los productos de un pequeño grupo de genes escenciales.

43 El aparato de replicación del fago T4

44 FIN