Animales de laboratorio como plataforma de generación de conocimiento. Dr. Martín Breijo Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación.

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1 Animales de laboratorio como plataforma de generación de conocimiento. Dr. Martín Breijo Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación.

2 En los avances de las ciencias de la vida, siempre estuvo presente la investigación con seres vivos.

3 Premio Novel de Medicina 2011 Cómo se activa el sistema inmunitario innato y el papel de las células dendríticas en el adaptativo (Bruce A. Beutler; Jules A. Hoffman; Ralph M. Steinman) Beutler y col (1998), descubrieron que ratas resistentes a LPS tenían una mutación en un gen que era muy similar al gen Toll de la mosca de la fruta.. J. Hoffman (1995), descubrió a partir de Drosophilas con mutaciones, receptores que estaban asociados a resistencia de bacterias (TLRs). R. Steinman (1973), descubrió un nuevo tipo de célula que llamó dendrítica. Él especuló que podía ser importante la activación de las células T del sistema inmune adaptativo

4 Premio Nobel de Medicina 2010. Robert Edwards por sus estudios y avances en la fecundación in vitro.

5 “Una técnica "de inmensa importancia " que ha permitido a la ciencia determinar por qué ciertas enfermedades afectan al ser humano a nivel celular y a aumentar el conocimiento sobre "numerosos genes en estado embrionario, la fisiología adulta, el envejecimiento y la enfermedad". CAPECCHI, SMITHIES Y EVANS “El Nobel premia a tres científicos pioneros en la manipulación genética de ratones” Premio Novel de Medicina 2007

6 - Andrew Z. Fire, Craig C. Mello Premio Novel de Medicina 2006 El premio ha recaído conjuntamente en Andrew Z. FIRE y Craig C. MELLO por el descubrimiento de la denominada interferencia de ARN, un mecanismo de silenciamiento génico mediante ARNs de doble cadena

7 Un animal de experimentación es: Un instrumento de medición, que nos permite obtener información válida a partir de trabajos experimentales. Una fuente de materiales de origen animal (células, factores solubles), que luego son usados con fines informativos, diagnósticos y terapéuticos.

8 El uso de animales de experimentación implica 2 tipos de desafíos y/o dilemas. PRÁCTICOS Que reactivo utilizar? Como producirlo? Como manipularlo? ESENCIALES ¿Qué problemas éticos genera experimentar con animales?

9 Aspectos Prácticos Queremos entender la realidad y a veces modificarla. Necesitamos modelos donde la variable sea nuestra pregunta

10 Clasificación de vertebrados utilizados en Investigación: Animal de Laboratorio : son aquellas especies de vertebrados domésticos tradiconalmente usado como animal de experimentación, capaz de dar una respuesta confiable y reproducible. Se tiende a que su homogeneidad somática, genética y sanitaria este controlada. Animal No Tradicional: son aquellas especies de vertebrados no domésticos que poco usados como modelos en investigación. Los criterios de manejo, alojamiento, métodos paliativos del dolor, punto final, técnicas de eutanasia, etc están de refinamiento. Animal de Interés Productivo: son aquellas especies de vertebrados domésticos de interés productivo utilizados para investigación. Se tiende a que su homogeneidad somática, genética y sanitaria este controlada Modelos con Vertebrados Invertebrados

11 Animal de Experimentación = Reactivo Biológico. Uniformidad Característica definida Reproducible Buena dosis respuesta Base para extrapolar al hombre u otros animales Estandarizado internacionalmente Necesitamos utilizar un producto de propiedades conocidas y mantenerlo de la misma manera. Aspectos Prácticos

12 Es importante que cuando seleccionemos un reactivo, su calidad esté en concordancia con el uso que se le va a dar. Al igual que los reactivos químicos, los proveedores comerciales ofrecen un mismo producto con varias calidades. Bioterio convencional con bajos niveles de control

13 Diabetes Research Models Common NameNomenclatureSpecies GLUT 4 * C57BL/KsJ- db/db- Tg(SLC2a4)1Jd m Mouse Goto-Kakizaki (GK) $ GK/TohiCskCrlj Crl Rat GSK3B * FVB/N-Tg(Mic2- tTA-GSK3) Mouse Spontaneously Hypertensive Heart Failure (SHHF) $ SHHF/MccGmi Crl-Lepr cp /Crl Rat Rip-HAT * FVB/N-Tg(Ins2- IAPP)RHF Soel Mouse RIP-HAT * CD:SD-Tg(ins2- IAPP)Soel Rat ZSF1 $ ZSF1- Lepr fa Lepr cp /Crl Rat Zucker Diabetic Fatty (ZDF) $€ ZDF-Lepr fa /CrlRat RESEARCH APPLICATION Type 2 diabetes*, hyperlipidemia, glucose intolerance, obesity, hyperinsulinemia *Note: We recommend male obese ZDF rats be fed Purina #5008 diet to induce programmed and consistent development of Type 2 diabetes. Female obese ZDF rats express a reproducible Type 2 diabetes phenotype when fed D12468 from Research Diets, Inc Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat ZDF-Lepr fa /Crl Líneas Clasicas Oncology Research Models Common NameNomenclatureSpecies 129 D931A * 129P2.B6J- Pik3cb tm3Bvan / Crl Mouse 129 flox * 129P2.B6J- Pik3cb tm1.1Bvan /Crl Mouse AKR * AKR/NCrlMouse B6 D910A * B6J.129P2- Pik3cd tm2Bvan / Crl Mouse B6 D931A * B6J.129P2- Pik3cb tm3Bvan / Crl Mouse B6 D933A * B6J.129P2- Pik3ca tm2Bvan / Crl Mouse B6 flox * B6J.129P2- Pik3cb tm1.1Bvan /Crl Mouse B6 lacZ * B6J.129P2- Pik3ca tm3Bvan / Crl Mouse

14 ¿Que factores que afectan la calidad de un animal de experimentación?. Genéticos. Nutricionales. Microbiológicos. Ambientales (físicos, químicos) La necesidad de utilizar un animal de calidad definida, implica mantenerlos en ambientes controlados

15 EJEMPLOS DE PÉRDIDAS DE CONTROL EN SISTEMAS DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

16 CASO 1. DBA/2 La producción de híbridos B6D2F1, se basa en la cruza de dos líneas consanguíneas. C57BL/6 X

17 Monitoreo genético de C57BL/6 Microsatélites Secuencias simples de ADN, con motivos repetidos, de entre 1 y 6 nucleótidos. En ratón, el 50% de microsatélites muestra polimorfismo entre las distintas líneas consanguíneas, muchas de las cuales pueden detectarse por PCR. PRIMERTamaño (pb) C57BL/6 Tamaño (pb) BALB/c Tamaño (pb) DBA/2 1 - D1Mit14180198202 2 - D11Mit38 76112 3 - D15Mit214 126134 4 – D7Mit301 115131 5 – D11Mit4250300

18 Resultados: Las líneas consanguíneas C57BL/6 y DBA, de origen no estaban contaminadas genéticamente. Es probable que un error de manejo, llevo a que un hibrido hembra, se mezclo con los harenes reproductores.

19 CASO 2. Ratones C57BL con: Camadas con menor desarrollo al esperado Pérdida de peso Sintomatología nerviosa. Prolapsos rectales Vaginitis Muy bajo consumo de ración Resultado: Ración autoclavada no palatable.

20 The Journal of Immunology, Vol 147, Issue 10 3632-3637, Copyright © 1991 by American Association of Immunologists Specific pathogen-free BALB/cAn mice are refractory to plasmacytoma induction by pristane LG Byrd, AH McDonald, LG Gold and M Potter Laboratory of Genetics, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892. Forty to sixty percent of conventionally (CON) raised BALB/cAnPt (BALB/c) mice develop plasmacytomas (PCT) when injected with three 0.5 ml i.p. injections of pristane. When CON- BALB/c mice were converted to specific pathogen free (SPF) status by foster nursing caesarean delivered term mice on C3H/HeN SPF mothers and maintained under strict SPF conditions, less than 5% of the mice developed pristane-induced PCT. FACS analysis of the cellular composition of oil granulomatous tissue revealed a dramatic influx of CD4+ cells in CON mice that was significantly reduced in SPF mice. Moreover, while both CON and SPF mice had similar patterns of gut flora colonization, only CON-BALB/c mice had occasional circulating antibodies to mouse hepatitis virus and Sendai viruses. Maintenance in strict SPF conditions, therefore, results in a prolonged state of relative Ag deprivation and a failure to continuously activate new T and B cell populations. The results suggest that PCT formation depends on exogenous antigenic stimulation and that the presence of minimal gut flora is insufficient to render these mice susceptible to PCT induction. CASO 3 Ej: Lewis y micoplasma

21 CASO 4.

22 Resultado: Cambio de respuesta se asoció a ruidos por reformas.

23 Para producir y/o experimentar correctamente debo contar: Buena infraestructura edilicia Buena infraestructura en equipamiento Buena calidad de insumos Personal de bioterios y usuarios entrenados. ASPECTOS PRACTICOS

24 PARA TENER ÉXITO EN EL OBJETIVO ES NECESARIO: Trabajo en equipo Mucha comunicación entre usuarios y bioterios. Planificación correcta de actividades

25 El uso de animales con fines científicos no es por sí deseable. Siempre que sea posible deben utilizarse otros métodos. En el estado actual de los conocimientos parece inevitable recurrir al uso de animales. Valorar y respetar al animal de experimentación es responsabilidad de usuarios e investigadores. ASPECTOS ESENCIALES

26 ReemplazoRefinamientoReducción Principios Generales (Russell y Burch, 1959) Evolución de la ciencia y la tecnología

27 ReemplazoRefinamientoReducción Bajo valor económico y afectivo

28 Los trabajos experimentales con animales pueden generar grandes avances; pero también daños que pueden ir de leves a graves.

29 Cuando hablamos de planificar un experimento debemos pensar en: Animales (macro y microclima, procedimientos etc) Operarios (Seguridad laboral, insumos de trabajo) Usuarios (Seguridad laboral, insumos). Comunidad (Residuos biológicos, etc.). ¿qué sucede si el investigador o los operarios del bioterio no cuentan con los implementos para trabajar en forma segura?

30 DEBEMOS ANALIZAR COSTOS EXPERIMENTALES Y ANALIZAR LOS PROTOCOLOS. EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL NO HAY ETICA SIN RECURSOS

31 Muchas gracias.

32 Sede Central Hospital de Clínicas Instituto de Higiene Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación. Facultad de Medicina. Especies BOVINOS OVINOS EQUINOS COBAYOS CONEJOS CABRAS RATAS RATONES GATOS PECES RANAS CERDOS MOSCAS