PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EN VIH/SIDA- parte 3

Presentación del tema: "PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EN VIH/SIDA- parte 3"— Transcripción de la presentación:

1 PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EN VIH/SIDA- parte 3
CARLOS ALVAREZ. MD.DTMH

2 Otras pruebas… Saliva: OraSure: Orina S: 99.24% E: 99.89% Calypte

3 GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDA Basada en la Evidencia COLOMBIA 2006
Diagnóstico en embarazo: Ofrecimiento y realización de la prueba recomendada con consentimiento para aceptación o rechazo. Indicaciones de repetición en tercer trimestre. Uso de pruebas rápidas Recomendaciones de interpretación

4 GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDA Basada en la Evidencia COLOMBIA 2006
Detección en el Hijo de Mujer Infectada : Indicaciones de carga viral. Flujograma de diagnóstico con pruebas de detección de ácidos nucleicos e interpretación.

5 GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDA Recomendaciones Prueba de genotipificación
No ordene pruebas de genotipificación en pacientes con problemas activos de incumplimiento, intolerancia, o inconsistencia en la toma de medicamentos (III A). Siempre confirme fracaso virológico y carga viral mayor a 1000 copias antes de ordenar una prueba de genotipificación (II A). La prueba de genotipificación debe realizarse en pacientes que se presentan con un segundo o tercer fracaso terapéutico previa autorización de experto en enfermedades infecciosas o VIH-SIDA (I B).

6 GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDA Recomendaciones Prueba de genotipificación
La prueba de genotipificación debe interpretarse con la participación de un experto en enfermedades infecciosas o en VIH-SIDA (I B). La conducta que se derive de la información de las pruebas de genotipificacion debe ser siempre supervisada por un experto en enfermedades infecciosas o en VIH-SIDA (IIIA). El paciente debe estar consumiendo el régimen que fracasa en el momento en que se le toma la muestra para la prueba de genotipificación o dentro de las dos a cuatro semanas posteriores a su suspensión (II B).

7 Mutaciones relacionadas con la resistencia a las drogas antiretrovirales
Inhibidores de la Proteasa L10I K20M D30N M36I M46I G48V I54V V82A I84V N88D L90M Saquinavir Indinavir Nelfinavir Ritonavir Amprenavir Mutaciones primarias Mutaciones secundarias Polimorfismos

8 Genotipo: predicción de resistencia
Magnitud de resistencia a drogas NO Todos los virus con L90M deberían tener resistencia uniforme a saquinavir Un factor desconcertante es la ausencia de correlación exacta entre el genotipo y la resistencia encontrada clinicamente. 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 HIV obtenidos de 78 pacientes

9 Fenotipo: medida directa de resistencia
1,000 100 10 1 Magnitud de resistencia a drogas Estos son los resultados del fenotipo. 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 HIV obtenidos de 78 pacientes

10 Fenotipo: medida directa de resistencia
1,000 100 10 1 Punto de corte de sensibilidad 40% de virus con L90M permanecen sensibles a saquinavir Magnitud de resistencia a drogas La interpretación es que probablemente no exista todavía expresión de este genotipo. 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 HIV obtenidos de 78 pacientes

11 Ensayo Fenotípico: ANTIVIROGRAM
PACIENTE PLASMA ( > 200 µl) RNA cDNA PR/RT GENES (amplicones) Aislamiento del gen PR/RT extración RT PCR Transfección del gen (Electropor) (MT4) VR Plásmido con genoma VIH (excep PR/RT) Virus WT PRO RT Delección & genes Clon proviral deleccionado A partir de la muestra de plasma del paciente y por una reacción de RT-PCR obtenemos el amplicones de los genes de la PR o RT objeto de estudio. Los VR se generan a partir de la transfección de células MT4 con el fragmento PRO o RT y un plásmido que contiene el genoma completo del VIH menos los genes PRO/RT La IC50 del VR se determina en cultivo midiendo la variabilidad de las células MT4 infectadas con el VR en presencia del fármaco. La sensibilidad de este virus quimérico frente a un determinado fármaco se valora cuantificando mediante el ensayo de MTT la muerte celular que induce. (En este método la IC50 del VR se compara con la IC50 de la cepa control HXB-2. El inconveniente de éste método es que requiere la amplificación y titulación previa del cultivo) Susceptibilidad del ensayo

12 Sensible: IC50 4< Cepa Ref Parc.Res:IC50 4-10 > Cep.Ref
SUSCEPTIBILIDAD Sensible: IC50 4< Cepa Ref Parc.Res:IC > Cep.Ref Resistente: IC50 +10> Cep.Ref Sensible: La IC50 del virus recombinante es al menos cuatro veces inferior que la de la cepa viral de referencia. Parcialmente resistente: La IC50 del virus recombinante es entre 4 y 10 veces superior al valor de la IC50 de la cepa viral de referencia. Resistente: La IC50 del virus quimérico es al menos 10 veces superior a la de la cepa de referencia

13 (Plásmido modificado de NL 4.3)
Phenosense (Virologic) PR/RT RT-PCR Plasma de paciente ARN VECTOR PROVIRAL (Plásmido modificado de NL 4.3) CLON VIRAL cDNA (gag/PRO/RT) PR/RT Apa I PinA I Purificar amplificado + secuenciar LTR Luc PR/RT A diferencia del ensayo anterior éste consiste en la generación de clones virales con la secuencia que codifica para la PR y para la RT del virus del paciente en estudio. Para ello, se obtiene el ARN viral a partir del plasma del paciente en estudio. A continuación se realiza una RT-PCR para obtener una cDNA que incluye parte de gen gag así como la secuencia codificante para la protesa y RT. Este amplificado es purificado y secuenciado (caracterizado geneticamente) para su posterior clonaje en un vector proviral. Es un plásmido modificado del clon molecular NL 4.3 del VIH. Este clon molecular presenta el gen que codifica por la luciferasa integrado en el sitio en que se deleccionó el gen env. Este gen indicador nos permite cuantificar la replicación viral.

14 MÉTODOS GENOTÍPICOS: Secuenciación
Cebador marcado para replicación Cadena a secuenciar 4 mezclas de reacción que incluye cada uno de los diferentes ddNTP que paran la replicación Productos de la reacción de replicación Separación de productos por electroforesis Plasma Extracción RNA viral RT-PCR cDNA Amplicones Electroferograma

15 Algoritmos Trugene HIV-1 Report Generator (Visible Genetics).
Retrogram Software v 1.2 (Viroloy Networks) ANRS AC11 v 2.000 Detroit Medical Center, Grupo de Aconselhamento Virológico, CHL V3.2, Rega v 5.0 (estos 5 accesibles a través de la empresa Advanced Biological Laboratories, SA) Resistance Collaborative Group, Stanford University HIV Database (estos 2 accesibles a través de Beta Test HIV Algorithm Comparison, Stanford University) ADRA (Los Alamos Resistance Database) Geno2phenosense(Arevir, Analyse Von Resistenzmutatione bei HIV).

16 VirtualPhenotype® - Cómo funciona
Información genotípica Información fenotípica Secuencia (pregunta a la base de datos) > > > muestras comprobadas Información de VirtualPhenotype (media del fenotipo)

17 vircoTYPE REPORT RESISTANCE ANALYSIS vircoTYPE page 1

18 Page 2: Details The second page is provided with the Expert Microbiologist/Virologist in mind:it gives all the back-up details from the analysis, including, for each drug, the distribution of samples in the database, which were resistant or susceptible, as well as Clinical Notes that give further insight on in vivo experience of viruses with a similar profile.

19 Informe de VirtualPhenotype®
Fármaco Pares en base de datos Proporción de muestras iguales: Por encima de rango normal de susceptibilidad, pero por debajo de valor clínico de corte 2, 3, 4 Veces de cambio en la IC50 (corte para el rango normal de susceptibilidad) Nombre comercial Por encima de rango normal de susceptibilidad 2 Nombre genérico En rango normal de susceptibilidad 2 Zidovudina Lamivudina Didanosina Zalcitabina Estavudina Abacavir Tenofovir DF Nevirapina Delavirdina Efavirenz Un componente de Kaletra®

20 ¿Qué es mejor? Fenotipo real: - Prueba real - Alta variabilidad intraprueba Costo !! Genotipo: - Interpretación compleja Fenotipo virtual: - Medida de probabilidad estadística - Mayor precisión - Problema en la definición de veces significativas: biológicos y clínicos

21 Mutaciones relacionadas con la resistencia a las drogas antiretrovirales

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