BANDAS OLIGOCLONALES EN LCR

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1 BANDAS OLIGOCLONALES EN LCR
ESCLEROSIS MULTIPLE BANDAS OLIGOCLONALES EN LCR Bioq. María Josefina Boero Hospital Italiano de Buenos Aires

2 Esclerosis Múltiple “Es una enfermedad inflamatoria, desmielinizante, neurodegenerativa de curso crónico del SNC”

3 INFLAMACIÓN DESMIELINIZACION GLIOSIS

4 DOCTOR, ¿ CUÁL ES LA CAUSA DE LA EM?
…………

5 Esclerosis Múltiple (EM)
Se piensa en un mecanismo autoinmune: “Debido a la destrucción selectiva de la capa de mielina y de las fibras nerviosas, y secundariamente un daño neuronal progresivo” Se caracteriza por la ocurrencia sucesiva de focos de desmielinización diseminados en tiempo y espacio en varias áreas del SNC, incluidos la región periventricular, la médula espinal, el tronco encefálico, el cerebro y el nervio óptico. Espacios: áreas múltiples de desmielinización y Tiempo: aparición de nuevas lesiones en los estudios de seguimientos, sin una causa conocida, aunque se piensa en un mecanismo autoinmune.

6 EM: Epidemiología La enfermedad suele comenzar entre los 20 y 40 años, con un pico máximo a los 30 años Es más frecuente en mujeres (2:1) y en caucásicos No se conoce las razones de la variación de prevalencia en el mundo, pero piensan que los factores genéticos y ambientales podrían ser la causa

7 EM: Distribución mundial
The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.

8 En el Mundo…. En Argentina….
La prevalencia más alta de la enfermedad (30 /100000) se encuentra en el norte de Europa, sur de Australia y centro de Norte América. En Argentina…. existen aproximadamente pacientes con EM en Europa Argentina es un país con una prevalencia de 18/100000, lo que significa que hay casos. Con 2.24 nuevos casos /año.

9 EM: Factores de riesgo Factor genético… Factor ambientales…
Se asocia a pacientes que presentan ciertos antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad HLA-DR2 Factor ambientales… En estos individuos la exposición a ciertos factores (infecciones virales, polisacáridos bacterianos, súper antígenos, toxinas) resultarían en la activación y proliferación del sistema inmune. EBV, HERPES VIRUS HUMANO 6, PARAMIXOVIRUS ENTRE OTROS

10 Fisiopatología

11 EM: Fisiopatología

12 EM: Fisiopatología Factores genéticos y ambientales 1 Factores locales: infección viral, stress metabólico 2 3 Citoquinas proinflamatorias pueden aumentar la expresión de moléculas en la superficie de LT y CPA MBP, MOG, glicoproteína asociada a mielina, proteína proteolipídica,β- cristalina, fosfodiesterasas y S-100 4 Up-regulation Down-regulation Injuria inmunológica mediada por Ac y activación del complemento Injuria mediada por células 6 PROTEÍNA BÁSICA DE MIELINA, GLICOPROTEÍNA OLIGODENDROCÍTICA DE LA MIELINA PROTEÍNA BÁSICA DE MIELINA Es una proteína de baja masa molar que proviene de la degradación de las vainas de mielina, primariamente en esclerosis múltiple, leucodistrofias y otras enfermedades desmielinizantes, y secundariamente en infecciones, intoxicaciones y lesiones vasculares. En todos estos casos, la proteína básica de la mielina es liberada al espacio extracelular, pasando posteriormente al LCR, donde su concentración puede ser medida 5 Resolución de la rta inflamatoria Remielinización espontanea Propagación de los canales de Na de los nódulos de Ranvier Injuria mediada por citoquinas Digestión de Ag de superficie de mielina por macrófagos Injuria directa de oligodendrocitos por CD8+ y CD4+ Axones desnudos The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.

13 EM: Fisiopatología En algunas lesiones la presencia de inmunoglobulinas y activación del complemento sugieren que los Ac tienen un rol en el desarrollo de la lesión. Se observa una distrofia primaria de los oligodendrocitos. Finalmente, en otras lesiones un borde de oligodendrocitos necróticos se ven adyacentes al borde de la placa activa.

14 EM: Fisiopatología El marco patológico de la enfermedad es la PLACA DESMIELINIZADA La placa es una zona bien demarcada caracterizada por la pérdida de mielina, con preservación del axón y formación de cicatrices astrociticas. La injuria irreversible axonal y la escasa población de oligodendrocitos progenitores resulta en la pérdida progresiva de la función neurológica. The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.

15 Manifestaciones clínicas
Debilidad de las extremidades Alteraciones cognitivas Pérdida de fuerza Fatiga Descoordinación en los movimientos Espasticidad Pérdida de memoria a corto plazo, depresión Falta de atención Dificultad para resolver problemas Lentificación del procesamiento de la información Alteración del juicio Labilidad emocional Neuritis óptica Disminución de la agudeza visual Visión borrosa Otros síntomas Disfagia Disartria Disnea Espasticidad Disfunción sexual Estreñimiento Síntomas sensitivos Parestesias Hiperestesia

16 EM: Patrones clínicos Discapacidad Tiempo EM RECURRENTE-REMITENTE: 85%
EM SECUNDARIAMENTE PROGRESIVA: 50% Discapacidad EM PRIMARIAMENTE PROGRESIVA: 10% EM PROGRESIVA RECURRENTE: 5% Tiempo

17 Diagnóstico

18 EM: Diagnóstico Nuevos criterios para el diagnóstico de EM se han publicado como resultado de la formación de un comité internacional Objetivo: simplificar la clasificación y acortar el intervalo entre presentación y diagnóstico Se requiere la presencia de hallazgos clínicos y paraclínicos ( RMN, potenciales evocados y análisis del LCR) Arch Neurol. 2005;62:

19 EM: Diagnóstico La RMN es sensible pero no específica para el diagnóstico de EM una cantidad de otras enfermedades pueden mimetizar con EM, ya sea clínicamente como a través de neuroimágenes. Los Potenciales evocados no son específicos, ya que las anomalías en las respuestas provocadas ocurren en un gran número de enfermedades neurológicas que tienen alteradas las vías que se estudian (vías visuales, auditivas, somato sensitivas o motoras). Los estudios en LCR tienen la ventaja de una mayor especificidad puesto que en población normal, no es frecuente hallar anormalidades de las inmunoglobulinas en este líquido biológico.

20 Diagnóstico Diferencial de EM
INFECCIOSAS Enfermedad de lyme Sífilis meningovascular Mielopatías por HIV o HTLV-1 AUTOINMUNES LES Sjögren Sarcoidosis Wegener VASCULARES Malformaciones vasculares de la espina dorsal Vasculitis primaria NEOPLASIAS Linfomas o gliomas Tumores de la espina dorsal Síndrome paraneoplásicos DEGENERATIVAS Ataxia espinocerebelar ENDOCRINAS/METABÓLICAS Hipotiroidismo Deficiencia de vit. E o B12 GENÉTICAS Leuecodistrofia metacromática

21 Laboratorio

22 Estudio del LCR: Proteínas
Las proteínas totales en LCR es el indicador más sensible de patología en el SNC El rango normal de proteínas es de mg/dl. Niños y añosos pueden tener rangos mayores Muchas enfermedades pueden aumentar la permeabilidad de la BHE llevando a un aumento de las proteínas Arch Neurol. 2005;62:

23 Estas enfermedades incluyen:
Bacterianas, virales y otras formas de meningitis Infiltración neoplásica de meninges Tumores cerebrales y espinales Polineuropatías Hernia de disco Infarto cerebral, hemorragias

24 Estudio del LCR: Proteínas
La albúmina, al no ser sintetizada en el SNC, sirve como un indicador de referencia para monitorear permeabilidad. La concentración de IgG debe tomar en consideración el estado de la barrera, para poder distinguir entre aumentos por síntesis intratecal y pasaje de proteínas plasmáticas. La determinación de ALBUMINA y IgG en LCR nos permite evaluar la integridad de la BHE y la síntesis de IgG en el SNC Se recomienda el uso del cosciente Alb LCR/ Alb suero, en lugar de PT, para evaluar disfunción de la BHE. Arch Neurol. 2005;62:

25 EM: Estudio del LCR Aspecto: Cristal de roca Leucocitos: normales
( Pleocitosis leve con predominio linfocitario) Glucosa: Normal Proteínas totales: Normal o liger. aumentado IgG LCR/IgG suero: elevada en el 90% de los casos La respuesta inmune humoral a los antígenos de mielina se refleja en un aumento de la concentración de IgG y la síntesis de bandas oligoclonales(BO)

26 EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, indica síntesis intratecal de IgG No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG. El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado

27 Condiciones que presentan BOC (+) en LCR:
Enfermedad Incidencia de BOC % Pruebas sugeridas EM 98 RMN PESS 100 Acs anti-sarampión Neurosifilis 95 Acs anti-treponémica Neuro-SIDA 80 Acs anti-HIV Neuro-Lyme Acs anti-borrelia Neuro-LES 50 Factor antinuclear Neuro-Behçet 20 C’3 PMN en LCR Ataxia-telangiectasia 60 IgA sérica Meningitis-uveítis de Harada PCR sérica Adrenoleucodistrofia Ácidos grasos de cadena larga Neuro-sarcoidosis < 5 Test de Kveim Encefalitis aguda (<7 días) <5 Acs antivirales Meningitis aguda (<7 días) Lactato en LCR, PCR Neoplasias TAC PESS PANENCEFALITISESCLEROSANTE SUBAGUDA E. J. Thompsom, The National Hospital for Neurology y Nerusurgery Queen Square.

28 EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado

29 El valor de este cosciente en un LCR normal es 0.5
Estudio del LCR: Indice IgG IgG LCR/ IgG suero Alb LCR/ Alb suero El valor de este cosciente en un LCR normal es 0.5

30 EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado

31 EM: Toma de muestra Se deben extraer 3-5 ml de LCR
Se debe tomar al mismo tiempo una muestra de sangre Conservación de la muestra: 1 semana: 2 a 8 °C -20 °C

32 EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Las proteínas son separadas de acuerdo a su pI en un gradiente estable y continuo de pH La carga de superficie de la molécula (anfotérica) se mantiene cambiando de acuerdo a su curva de titulación, hasta alcanzar una posición de equilibrio a lo largo del gradiente de pH Esa posición de equilibrio la alcanza donde el pH es igual al pI de la molécula Es decir, que en IEF las proteínas son continuamente desaceleradas hacia una zona de equilibrio donde la carga neta es cero( pH=pI) Esta técnica requiere crear y mantener en el gel un gradiente continuo de pH, lo que se logra por el pasaje de la corriente eléctrica a través de una solución de compuestos anfotéricos, cuya característica principal es que tienen pI muy cercanos, abarcando un dado rango de pH IEF, POR SU SENSIBILIDAD, ES EL METODO RECOMENDADO PARA LA SEPARACION DE PROTEINAS IEF= ISOELECTRIC FOCUSING es una tecnica electroforetica especial La diferencia entre electroforesis de zona es que en la electroforesis convencional la separación de la muestra se realiza a un pH constante dado por el medio en el que se realiza la corrida, en IEF el pH cambia a lo largo del gel.

33 EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas NO se debe concentrar el LCR Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG

34 Concentración de IgG en LCR
EM: Preparación de las muestras Concentración de IgG en LCR LCR SUERO > 20 mg/L Diluir para obtener una conc. de 20 mg/L de IgG Diluir para obtener una conc. de 20 mg/L de IgG 10-20 mg/L Sin diluir Diluir para obtener una conc. de IgG identica a la del LCR < 10 mg/L Concentrar el LCR para obtener una conc. de IgG entre 10 y 20 mg/L Similares concentraciones de IgG para suero y LCR nos aseguran corridas óptimas

35 EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas NO se debe concentrar el LCR Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG * Y PARA DEMOSTRAR LA DIFERENCIA O LA SIMILITUD DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS IgG EN EL SUERO O LCR.

36 EM: Isoelectroenfoque
Ventajas Es una técnica de equilibrio y por lo tanto los resultados no dependen del modo de aplicación o del tiempo de operación Se mide un parámetro intrínseco fisicoquímico de la proteína (pI) Permite la resolución excelente de proteínas que difieren en 0.02 unidades de pH en sus pI, que pueden ser excelentemente separadas en bandas muy finas debido al efecto de focalizado

37 EM: Isoelectroenfoque
Limitaciones Sólo sustancias anfotéricas pueden ser separadas Los anfolitos y los péptidos son reactivos a los mismos colorantes, por ello se deben usar coloraciones específicas Péptidos cortos no focalizan ya que son isoeléctricos en casi todo el rango de pH(4-8)

38 IEF/PAGE Tinción con plata vs IEF/Inmunofijación
Resultado PAGE/IEF con Tinción Ag IEF con Inmunofijación Positivo verdadero 14 33 Falso positivo 12 2 Clin Chem 2000;48:1578

39 N° total de pacientes con EM
Sensibilidad y especificidad de IEF para EM Origen N° total de pacientes N° total de pacientes con EM Sensibilidad,% Kostulas et al 1114 58 100 McLean et al 1007 82 95 Ohman et al 558 112 96 Especificidad % Beer et al 189 98 87 Paolino et al 44 26 86 La presencia de BOC está fuertemente Relacionada (>95%) con EM Clin Chem 2000;48:1578

40 Interpretación de IEF Patrón 1: Normal (no BO en LCR ni en suero)
Patrón 2: Esclerosis Múltiple (si BO en LCR, no en suero) Patrón 3: Enfermedad sistémica (algunas bandas en LCR y adicionales en concordancia con suero) Patrón 4: Inflamación sistémica (patrón de bandas idéntico en LCR y suero) Patrón 5: Gammopatía monoclonal (patrón monoclonal en espejo en LCR y suero)

41 Interpretación de IEF 5 PATRONES Normal IgG síntesis local
Síntesis no local Banda monoclonal “splitted” en varias bandas en IEF

42 Interpretación de una única banda en LCR
La presencia de una banda solitaria en LCR debe ser interpretada en conjunto con hallazgos clínicos y en suero. Su presencia está asociada a linfoma, pero también es observada en sujetos normales y no excluyen el diagnóstico de EM. En series de pacientes seguidos por 6 años las dos terceras partes de los pacientes revertían el patrón, pero aproximadamente 1/3 desarrollaban una respuesta intratecal con diagnóstico de EM o síndromes desmielinizantes. Sin embargo, en la mayoría de los series la banda única es poco común.

43 Ejemplos de los perfiles
Patrón 1

44 Ejemplos de los perfiles
Patron 2 Síntesis local EM Se pueden observar bandas oligoclonales en LCR pero ausentes en el suero policlonal Más del 95% de los pacientes con esclerosis múltiple presentan bandas oligoglonales en el líquido cefalorraquídeo indicando una síntesis intratecal de inmunoglobulinas. No hay correlación entre la presencia de bandas y el proceso desmielinizante. las Bandas pueden estar presentes aunque el nivel de inmunoglbulinas en LCR sea normal Una vez que la respuesta oligoclonal está establecida se mantiene durante la vida del paciente ( escepto en algunos procesos infecciosos).

45 Síntesis sistémica+local
Ejemplos de los perfiles Patron 3 Síntesis sistémica+local Patrón « mayor que » Monoclonal componente Patrón 3: Enfermedad sistémica (algunas bandas en LCR y adicionales en concordancia con suero) bandas adicionales bandas adicionales

46 Ejemplos de los perfiles
Patron 4 Bandas Idénticas « En espejo » Esto representa una fuente predominantemente sistémica de Acs. Se puede observar este patrón en un síndrome guillaimbarré. Tipo 4 Patrón 4: Inflamación sistémica (patrón de bandas idéntico en LCR y suero)

47 Ejemplos de los perfiles
PATRON 5 Bandas Monoclonales Patrón 5: Gammopatía monoclonal (patrón monoclonal en espejo en LCR y suero)

48 SUERO LCR 3 1 2 4 5 6 7 8 9

49 HYDRAGEL 9 ISOFOCUSING sebia
LCR SUERO CN CP

50 SUERO LCR

51 CONTROL DE CALIDAD Control externo Control interno
Hay controles externos de calidad (CAP) Control interno Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico

52

53 CONTROL DE CALIDAD Control externo Control interno
Hay controles externos de calidad (CAP) Control interno Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico

54 Conclusión

55 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
1- El análisis del LCR es una parte integral del diagnóstico de EM 2- El único análisis informativo es el establecimiento cualitativo de IgG en LCR, utilizando IEF seguido de una técnica de detección inmune( fijación o blotting). Esta es la técnica declarada “gold-standard” por la FDA 3- El análisis cualitativo debe ser realizado en LCR sin concentrar y debe ser comparado directamente con un suero corrido simultáneamente en el mismo ensayo Arch Neurol. 2005;62:

56 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
4- Corridas óptimas usan similares concentraciones de IgG para suero y LCR 5- Controles positivos y negativos deben ser corridos en cada set de muestras y el gel debe ser desechado si no se ven bien las bandas en los controles 6- El informe del LCR debe ser realizado en términos de los 5 patrones reconocidos Arch Neurol. 2005;62:

57 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
7- La interpretación debe ser realizada por una persona experta en la técnica utilizada 8- Considerar una nueva punción en el caso de una alta sospecha clínica pero resultados negativos del LCR, o solo mostrando una banda 9- El análisis cuantitativo de IgG es un buen complemento informativo, pero no se considera un substituto al análisis cualitativo, el cual posee la más alta especificidad y sensibilidad Arch Neurol. 2005;62:

58 Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
10- Cuando se realice el dosaje de IgG en LCR, fórmulas no lineales deben ser usadas para medir integridad de la BEH, midiendo la relación de albúmina en LCR/Albúmina en suero 11- Los laboratorios que realicen de rutina la búsqueda de Bandas Oligoclonales en LCR deben poseer controles internos y externos de calidad para asegurar un alto standard de confiabilidad y desempeño Arch Neurol. 2005;62:

59 BIBLIOGRAFIA Recommended Standard of Cerebrospinal Fluid Analysis in the Diagnosis of Multiple Sclerosis . A Consensus Statement Mark S. Freedman, MSc, MD, FRCPC; Edward J. Thompson, DSc; Florian Deisenhammer, MD; Gavin Giovannoni, PhD; Guy Grimsley, PhD; Geoffrey Keir, PhD; Sten Öhman, PhD; Michael K. Racke, MD; Mohammad Sharief, PhD; Christian J. M. Sindic, MD, PhD; Finn Sellebjerg, MD, PhD, DMSci; Wallace W. Tourtellotte, MD, PhD . Arch Neurol. 2005;62: Multiple sclerosis.Noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker BG. N Engl J Med 2000;343: Multiple Sclerosis — The Plaque and Its Pathogenesis Elliot M. Frohman, M.D., Ph.D., Michael K. Racke, M.D., and Cedric S. Raine, Ph.D., D.Sc. The new england journal o f medicine2006;354:

60 BIBLIOGRAFIA E. J. Thompson. Líquido cefalorraquídeo en la Esclerosis Múltiple. The National hospital for Neurology and Neurosurgery Queen Square. London. Joaquín A. Peña, Eduardo Mora de la Cruz, Cecilia Montiel-Nava. Enfermedades inflamatorias desmielinizantes. Neurología Pediátrica 3° edición. Stephen L. Hauser, Donald E. Goodkin. Esclerosis Múltiple. Principios de medicina interna. Harrison. Esclerosis Múltiple en la infancia. Silvia N. Tenembaum. Revista Española de Esclerosis Múltiple N°3:2007. El estudio de laboratorio en el diagnóstico diferencial de la Esclerosis Múltiple. Francisco Coret Ferrer, Bonaventura Casanova Estruch. Hospital Clínico Universitario; Hospital Universitario La Fe, Valencia. Recomendación para el estudio de las proteínas del líquido cefalorraquídeo Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Química Clínica 2002;83-90.

61 MUCHAS GRACIAS….