“Arrays de cDNA” Curso de Postgrado Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-06) Carles J. Ciudad. Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de.

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1 “Arrays de cDNA” Curso de Postgrado Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-06)
Carles J. Ciudad. Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia Molecular. Fac Farmacia. UB.

2 Una Vieja Idea con una tecnología moderna
Determinar la expresión génica a mRNA Un Array es un Multi-Northern Técnica basada en la hibridación Arrays ( genes), tamaño grande. Marcaje radiactivo Microrarrays (hasta 40,000 genes) micro. Marcaje fluorescente

3 APLICACIONES DE LOS ARRAYS
DEFINIR PERFILES DE EXPRESIÓN GENICA (EN DIFERENTES TEJIDOS, ESTADOS DE DESARROLLO, TRATAMIENTOS: complementar funcionalmente el proyecto genoma humano) ESCRUTINIO DE MUCHOS GENES SIMULTÁNEAMENTE (ventajas respecto RT-PCR, RNAse protection, Northern analysis) INVESTIGAR PROCESOS NORMALES Y PATOLÓGICOS (comparación de tejidos) DESCUBRIR DIANAS TERAPÉUTICAS

4 PLATAFORMA BD-CLONTECH DISPOSICIÓN GENES

5 NATURALEZA DE LOS ARRAYS
LO CONSTITUYEN CENTENARES DE cDNAs INMOBILIZADOS SOBRE MEMBRANAS DE NILÓN (8X12cm) CARGADAS POSITIVAMENTE (dup o singli) CADA cDNA CONTIENE bp, (10ng) (AMPLIFICADAS DE REGIONES DE mRNA SIN COLA DE POLI-A, ELEMENTOS REPETITIVOS O ALTAMEN-TE HOMÓLOGOS, Y QUE NO HIBRIDEN CON OTRAS SECUENCIAS DE GENES PRESENTES EN EL ARRAY) SON ESPECÍFICO DE ESPECIE CONTIENEN CONTROLES NEGATIVOS (PLÁSMIDOS,BACTERIOFAGOS), Y POSITIVOS (HOUSEKEEPING GENES) QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA NORMALIZAR

6 METODOLOGÍA d’ARRAYS - EXTRACCIÓN DE RNA (poliA o total)
* comprobar la calidad - SÍNTESIS DEL cDNA Y MARCAJE * MMLV-RT * a-[32P]-dATP ó a-[33P]-dATP * Primers específicos (1176) - PURIFICACIÓN DE LA SONDA * sephadex G-50 - HIBRIDACIÓN * DNA inespecíficos * 68ºC OVN - LAVADOS * hasta 0,5 XSSC, 0,5% SDS - CONTACTAR CON PLACAS DE EUROPIO (días) - ANÁLISIS, NORMALIZACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

7

8

9

10 POLI A+ o RNA TOTAL

11 Normal vs Diabético (Arrays de 8000 genes)

12 NORMALIZACIÓN EN LOS ARRAYS
LAS MEMBRANAS PUEDEN MOSTRAR DIFERENTES GRADOS DE HIBRIDACION DIFERENCIAS EN LA CALIDAD DEL RNA O EN LA SINTESIS DE LOS cDNAs NORMALIZACIÓN UTILIZANDO HOUSEKEEPING GENES NORMALIZACIÓN UTILIZANDO TODOS LOS GENES DEL ARRAY (GLOBAL NORMALIZATION)

13 CUANDO SE CONSIDERAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS ?
GENERALMENTE CUANDO HAY DIFERENCIAS DE 2 o MAS VECES (INCLUSO MENOS DE 2 VECES EN EL CASO DE MENSAJES SOBRE-ABUNDANTES) EN EL CASO DE CAUSAR REDUCCIONES DE LA EXPRESIÓN (ALREDEDOR DE 0.5 VECES)

14 (Leucemia mieloide crónica)
Genómica de la resistencia al MTX K562 (Leucemia mieloide crónica) HT29 (Cáncer de colon) I. Análisis genómico de los cambios de expresión II. Identificación de posibles dianas para el diseño de quimiosensibilizadores en la terapia con Metotrexato

15 Dosis respuesta al MTX en K562

16 CUANTIFICACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS CON ARRAYS

17

18

19 GeneSpring (Silicon Genetics/Agilent)
7.2

20 ARRAY SCATTERING.CNT

21 ARRAY SCATTERING.MTX

22 LIST-OVER 2

23 Clasificación Funcional

24 TREE-DOSE RESPONSE MTX

25 COMPROBACION DE LOS RESULTADOS
RT-PCR CUANTITATIVO (En genes con diferencias de 2-5 veces >70% positivos; en superiores a 5 veces >90% positivos) NORTHERN ANALYSIS RNAse PROTECTION WESTERN ANALYSIS ANALISIS DE PROTEINAS EN 2D

26 Expresión de la IMPDH en células K562 tratadas con Mtx 24h
Validación de los resultados por RT-PCR cuantitativa IMPDH2 APRT MTX (M) CNT 3x10-8 M 3x10-7 M 50 100 150 200 250 300 Niveles de mRNA para la IMPDH (% respecto el control)

27 Sonda Taq-Man

28 SÍNTESIS DE NUCLEÓTIDOS PÚRICOS
ADENILSUCCINATO LIASA ADENILSUCCINATO SINTETASA ADENILSUCCINATO AMP IMP IMPDH XANTILATO GMP INHIBIDORES DE LA IMPDH O OH CONH2 BENZAMIDA RIBÓSIDO CH3 HO O O OH S N CONH2 TIAZOFURINA HO O O CH3O CH3 ACIDO MICOFENÓLICO

29 BENZAMIDA RIBÒSID BENZAMIDA RIBÒSID (M)
CÈL.LULES RESISTENTS A 10-7 M DE MTX 2 4 6 8 1 C O N T R L - 7 M 3 X 5 BENZAMIDA RIBÒSID (M) + B

30 Plataforma ABI

31 ABI-Arrays

32 Equipo ABI

33 Plataforma Affymetrix

34 Arrays de Affymetrix (Alta densidad)

35 Ampliación Array Affymetrix

36 Arrays fotolitográficos

37 Detalles Técnica Array Affymetrix

38 Hibridación Array Affymetrix

39 Detección Array Affymetrix

40 Tipos de Arrays de Affymetrix

41 Types of Genome Microarrays by Affymetrix

42 GeneChips Human Genome Arrays

43 Detector Affymetrix

44 Microarray Affy HGU133A.2 (22.000 genes)

45 Microarray Affy HGU133A.2 (2-fold)

46 Microarray Affy HGU133A.2 Plus
(Chromosome view-4 fold)

47 Curated pathways - Translation Factors

48

49 Microarray Affy HG U133A.2 plus (54.000 genes)
(full genome)

50 Microarray Affy HGU133A.2 plus (4-fold)

51 4-fold list

52 DHFR

53 Software for curated pathways analysis and generation of BANs (Biological Association Networks)

54 For this example open Microsoft excel
and enter the following gene symbols. Then copy this list. This is a list of genes that are differentially expressed based on microarray experiments

55 Build BAN

56 1. Find putative regulators
2. Set Filters Filter to include only expression regulation interactions

57

58 NLP (Natural Language Processing)

59 Common regulators AKR1C1

60 Sumario Estudios de Genómica Funcional para detectar dianas terapéuticas con que sensibilizar el tratamiento con Metotrexato Macroarrays (1,2K) ---> Microarrays con todo el Genoma (54K) Métodos de Deteción de Dianas: Listados de Genes Diferencialmente Expresados (GeneSpring) Clasificación por Gene Ontology (GO) Curated Pathways (KEGG, GeneMAPP, PathwayAssist) BANs (Biological Association Networks) (PathwayAssist, Ingenuity) Validaciones: RNA Proteína Actividad Funcionales: Inhibidores Químicos Moléculas Antisentido (Oligonucleótidos Antisentido, RNA interferencia)