DIAGNOSTIGO GENETICO PREIMPLANTACIONAL Manuel Gasco.

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1 DIAGNOSTIGO GENETICO PREIMPLANTACIONAL Manuel Gasco

2  El diagnóstico genético preimplantacional (DGP) es el estudio del material genético del embrión para detectar determinadas alteraciones. Con este estudio genético parcial podemos seleccionar los embriones cromosómicamente normales antes de su transferencia al útero materno.

3 Aneuploidías  Monosomías  Trisomías  Triploidías

4  La técnica consiste en extraer una o dos células de un embrión de más de seis células para analizar su material genético.

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6 Three day old embryos

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11  FISH: Hibridación "in situ" con sondas fluorescentes de DNA.  PCR  Cromosomas: X, Y, 13, 16, 18, 21 y 22

12 FISH  Sondas fluorescentes q se ligan a cromosomas específicos y son marcadas con biotina, estos son detectados con anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos y se observan bajo microscopía de fluoerescencia.

13 X Y Interphase nucleus

14 Normal Diploid Triploid Tetraploid Missing chromosomes Normal Diploid Triploid Tetraploid Missing chromosomes

15 Monosomy Double trisomy PGD

16 Lepidium meyenii (Maca) incrementa el tamaño de la camada en ratonas adultas normales Ruiz Ana, Stephanie Salazar, Norma Aspajo, Julio Rubio, Manuel Gasco, Gustavo Gonzales. Instituto de Investigaciones de la Altura Departamento Académico de Ciencias Biológicas y Fisiológicas Facultad de Ciencias y Filosofía Universidad Peruana Cayetano Heredia

17 INTRODUCCION Maca es una crucifera q crece exclusivamente entre 3800 y 4500 msnm en los andes centrales peruanos y ha sido utilizada por siglos como nutriente y como potenciador de la fertilidad. Estudios previos han demostrado efectos positivos de la maca sobre la espermatogénesis (Gonzales GF, 2001, 2003, 2004; Chung, 2005; Bustos-Obregòn, 2005) y sobre el comportamiento sexual (Zheng BL, 2000; Cicero AF, 2001, 2002) mientras que en hembras solo hay un estudio reportado donde determinan que la maca no modifica la tasa de implantación en ratonas (Oshima M, 2003).

18 OBJETIVO Determinar el efecto del extracto acuoso de Maca en ratonas adultas sobre los índices reproductivos y peso uterino (ratonas ovariectomizadas).

19 METODOS Ratonas de la cepa Balb/C, fueron divididas en 3 grupos: Indices ReproductivosSitios de Implantación Peso Uterino Ratas Ovariectomizadas Vehículo Maca 1 g/kg Maca 0.5 g/kg Vehículo Maca 1 g/kg Vehículo

20 Preparacion del Extracto Acuoso El hipocótilo seco molido se hierve en agua durante 2 hrs, se filtra y se refrigera a -70 o C y luego al proceso de liofilizado. 2.2 g del liofilizado se diluye en agua destilada hasta obtener una dosis de 1g/kg.

21 Estudio de los sitios de Implantación El tratamiento fue durante 22-28 días (15 días previos a la monta y durante los primeros 7 días de gestación). Las ratonas fueron sacrificadas al día 7 de preñez, el útero fue removido y se observaron los sitios de implantación, los embriones fueron contados y pesados.

22 Estudio de los Indices Reproductivos 15 días previos a la monta, durante la preñez y 21 días post parto, las hembras fueron administradas con maca o vehículo. Se registró el número de crías vivas al día 4 y 21, el día de la abertura vaginal y la tasa sexual (fracción masculina).

23 INDICES REPRODUCTIVOS Indice de Fertilidad (♀ preñadas/♀copularon) X 100 Indice de Gestación (♀ con crías vivas/♀ preñadas) X 100 Indice de Viabilidad Post-natal (crías vivas día 4/crías vivas) X 100 Indice de Viabilidad al destete (crías vivas al día 21/crías vivas día 4) X 100

24 Efecto estrogénico de Maca ? Ratonas ovariectomizadas 30d Administró 42 días de Maca o Vehículo

25 Análisis Estadísticos Normalidad de los datos: Test de Kolmogorov-Sminorv. Peso corporal, sitios de implantación, longitud de la gestación y tamaño de camada se evaluaron con el test t de Student’s. Analisis multivariado fue utilizado para determinar si el tratamiento con maca influye sobre el número de crías y sobre el día de la abertura vaginal. Los índices reproductivos fueron analizados con el test de proporción pareada. P<0.05 fue estadísticamente significante.

26 RESULTADOS

27 Sitios de Implantación

28 Longitud de la Gestación

29 Efecto de la maca sobre el tamaño de la camada * P<0.05 respecto al grupo vehículo

30 Día del Abertura Vaginal

31 Ratonas Ovariectomizadas *

32 CONCLUSIONES La administración de maca (1 g/kg) a ratones hembras normales en edad reproductiva incrementa el tamaño de la camada, sin afectar los índices de fertilidad, de gestación, de viabilidad post-natal, de viabilidad al destete, número de implantaciones y apertura vaginal. La administración de maca (0.5 g/kg/) aumenta el peso uterino en ratonas ovariectomizadas, luego de 42 días de tratamiento.

33 RATAS TRATADAS CON MACA NEGRA (Lepidium meyenii) DURANTE UN CICLO ESPERMATOGÉNICO J. Nieto, M. Gasco, J.Rubio, S. Yucra, GF Gonzales Instituto de Investigaciones de la Altura Facultad de Ciencias y Filosofía Universidad Peruana Cayetano Heredia

34 INTRODUCCIÓN La espermatogénesis en rata dura 12.5 días. La Maca presenta diferentes ecotipos de acuerdo al color de su hipocotilos (13 descritos). La Maca amarilla, roja y negra obtenidas de Carhuamayo Junín, tienen diferentes componentes nutricionales al compararlos entre ellos. (Yllescas, 1994) 2005 : Effect of short-term and long-term treatments with three ecotypes of Lepidium meyenii (MACA) on spermatogenesis in rats. (C. Gonzales, J. Nieto, S Yucra, J. Rubio, M. Gasco, C. Góñez, S. Miranda and GF Gonzales) (en revisión) Maca Negra tuvo el mejor efecto en conteo de espermatozoides y motilidad; maca amarilla tuvo un efecto intermedio; mientras que maca roja no tuvo efectos a nivel de estos parámetros.

35 Efectos de diferentes ecotipos de Maca ( 42 días) en la longitud del estadío VIII del epitelio del túbulo seminífero (cm.), conteo de espermátides, producción diaria de espermatozoides (DSP) y tránsito de espermatozoides en ratas. Los datos son promedio ± EE. *P<0.01; **P<0.02 with respect to control group. Number of rats per group is between parentheses.respecto al grupo control. El número de ratas por grupo están entre los paréntesis.

36 OBJETIVO GENERAL Determinar el efecto de la maca negra, un ecotipo de la maca (Lepidium meyenii) sobre la producción diaria de espermatozoides, conteo de espermátides, conteo de espermatozoides y niveles de hormonas en un ciclo espermatogénico.

37 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar el efecto de la maca negra a diferentes tiempos de administración(1,3,5,7 y 12 días) durante un ciclo espermatogénico. Determinar el efecto de la maca negra en la histología del testículo y del epidídimo durante un ciclo espermatogénico. Determinar el efecto de la maca negra sobre los niveles de testosterona intratesticular y sérica.

38 MÉTODO Se administró a ratas Holtzman adultas 2gr/Kg de MN (666.6 mg.) y vehículo durante 1, 3, 5, 7, y 12 días. Un día después de cada tratamiento las ratas fueron sacrificadas y evaluadas. Se pesaron los órganos sexuales: epidídimos, testículos, vesícula seminal y próstata. Se evaluaron los niveles de testosterona sérica e intratesticular.

39 RESULTADOS

40 Producción Diaria de espermatozoides (DSP) (p<0.05)

41 Conteo de espermatozoides en epidídimo

42 Conteo de Espermatozoides en el Conducto deferente

43 MN 7 DIAS VS MN 12 DÍAS

44 Área tubular y luminal maca negra durante 7 y 12 días *P<0.05 respecto al area tubular Se contaron 20 tubulos por animal, 100 por grupo.

45 Efectos de Maca Negra en los túbulos seminíferos administrada a ratas durante 7 y 12 días. A,C: Grupos controles de ratas tratadas durante 7 y 12 días, respectivamente; B,D: Maca Negra tratada durante 7 y 12 days, respectivamente. HE stain. ×100 magnification. Las barras representan 500 um.

46 Histología de la cola del epidídimo en ratas machos adultos tratadas con Maca Negra durante 7 y 12 días. A, C: grupos Control de ratas tratadas durante 7 y 12 días, respectivamente; B, D grupos de Maca Negra (2g/kg) tratada durante 7 y 12 días, respectivamente. HE stain. Magnificación: X 10. Las barras representan 500 um.

47 MACA NEGRA 7D TESTOSTERONA INTRATESTICULAR

48 Niveles de testosterona Intratesticular (TTI) y testosterona sérica (TS)- ng/g testículo CMN TTI16,89 ± 2.0317,22 ± 3.67 T SERICA264.73 ± 34.11229.46 ± 47.18