RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO. ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE DIVERSIDAD MOLECULAR Problemática: 1. Necesidad de.

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1 RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO

2 ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE DIVERSIDAD MOLECULAR Problemática: 1. Necesidad de nuevas actividades 2. Métodos basados en la estructura: gran requerimiento Mediante la evolución dirigida pretendemos mimetizar los procesos naturales de selección

3 Ventajas: 1. Empleo de elevado número de variantes 2. Posibilidad de resumir siglos de evolución en días 3. Amplio uso en biología molecular Inconvenientes: 1. Necesidad de un buen sistema de selección GENERACIÓN DE DIVERSIDAD

4 Librería (población de individuos) Individuos Identificación Generación de diversidad Selección Análisis Materia origen

5 EL PROBLEMA DE LA DIVERSIDAD Repertorio natural de Ab 10 12 Oligonucleótidos degenerados (8 aa´s) 20 8 =2x10 10 Electroporación E. coli 10 9 /µg ADN Librería de phage display 10 8 Librería de ribosome display 10 12 Librería combinatoriales>10 12

6 GENERACIÓN DE DIVERSIDAD 1. Mutagénesis química 2. Mutagénesis con cepas hipermutadoras 3. PCR 4. “DNA shuffling” 5. Phage display 6. Ribosomal display

7 MUTAGÉNESIS QUÍMICA * Mutágeno: EMS, HA,... * Supervivencia: 0,1-10% CEPAS HIPERMUTADORAS * E. coli XLI-red (mutD mutS mutT) PCR * Taq pol: error 1/10000 por ciclo * sales de manganeso * nucleótidos desbalanceados

8 “DNA SHUFFLING”

9 The structure of Fabs

10 Antigen binding by CDRs in scFvs

11 Expression of antibody fragments in E. coli V H C H1 V L C L Anchor-protein IM P Fab OM V H V L NH 2 NH 2 C H1 C L SS COO - COO - Fab

12 Expression of antibody fragments in E. coli Anchor-protein V H V L linker OM IM P scFv NH 2 V H V L COO -

13 Massive cloning of V-genes by PCR B-cells cDNA PCR mRNA Spleen Hybridoma Blood Combinatorial synthesis

14 Assembly of V genes as scFvs VH fragmentsVL fragmentsLinker Homology driven amplification Sfi I Not I

15 Assembly of V genes as scFvs

16

17 The filamentous phages: M13 life cycle

18 The protein gp3 of M13phage

19 Cloning of scFv genes into phagemids bla Sfi INot I ColE1 oriM13 ori gene 3 VHVL (Ap r ) pCANTAB-5E plac scFv pIII M13 phage pVIII coat Phagemid DNA

20 scFv-SELECTION MIMICS THE IMMUNE SYSTEM Antigen Infect E. coli ** Amplification ** Binding ** Phab library ** Expression of scFv Elution

21 ARM (RIBOSOME) DISPLAY