6 LAGARTOS 3 LAGARTOS 1 LAGARTO CRISTALES DE PROTEÍNA Tamaño. Forma Frágiles. Sensibles - Interacciones débiles - Alto contenido de solvente (20-80%)

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2 6 LAGARTOS 3 LAGARTOS 1 LAGARTO

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4 CRISTALES DE PROTEÍNA Tamaño. Forma Frágiles. Sensibles - Interacciones débiles - Alto contenido de solvente (20-80%) * Difusión Derivados complejos * Estructura Nativa No-centrosimétricos - Sólo 65 G. Espaciales Alto volumen celdilla elemental - Gran número de reflexiones - Baja intensidad del espectro - Intensidad decrece drásticamente en el tiempo

5 CRISTALIZACIÓN Principio: - Mínimo de solubilidad - Población única * Difusión Derivados complejos * Estructura Nativa Factores: - {Proteína}: 5-30 mg/ml - {Precipitante}: sales, disolventes, PEG - pH: buffer - T: 4,20º - Aditivos: - Iones M - Inhibidores - agentes reductores

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7 DIFUSIÓN DE VAPOR Precipitante Proteína + Precipitante

8 1mm

9 N2N2 X-Ray Detector

10 La debe ser proporcional al tamaño del objeto. La distancia entre puntos es inversamente proporcional a la distancia entre nudos de la red. A medida que nos alejamos del centro la difracción es más débil. La geometría de los puntos de difracción está relacionada con la geometría de la red.

11 PROBLEMA DE LA FASE Espacio Real Espacio Recíproco Densidad electrónica  (x y z) Factor de estructura |F(h k l)| +  (h k l) TF siempre ???  (x y z) = 1/V  |F(h k l)| exp {-2  i (hx+ky+lz)+ i  (h k l)} I(h k l)  |F(h k l)| 2 ?? SOLUCIÓN Remplazamiento Molecular Remplazamiento Isomorfo MAD

12 FAMILIA ESTRUCTURAL GLOBINAS Hemoglobin (ascaris suum)Hemoglobin (lucina pectinata)Hemoglobin (urechis caupo) Myoglobin (sperm whale) Leghemoglobin (lupinus luteus)Hemoglobin (glycera dibranchiata) 1mbc 2gdm 2hgb 1flp1ithb 1ash Percentage identity matrix 1flp 100 1ithb 22.8 100 2gdm 21.2 18.0 100 1mbc 18.5 15.1 17.0 100 2hbg 24.4 23.1 19.9 22.1 100 1ash 13.3 10.1 15.8 15.9 14.6

13 REMPLAZAMIENTO MOLECULAR Determinar las posiciones de las moléculas dentro de la celdilla cristalina. Modelo Cuerpo Rígido Función de Rotación Función de Translación Parámetros: - Completitud y calidad de los datos. - Homología entre el modelo molecular y las moléculas reales que constituyen el cristal ( > 30%). - Tamaño del modelo molecular respecto al contenido de la celdilla.

14 REMPLAZAMIENTO ISOMORFO MULTIPLE - MIR Incluir átomos pesados en el cristal nativo que queden en posiciones fijas de la molécula sin deformar ni la celdilla ni la conformación de la proteína. LAS DIFERENCIAS EN INTENSIDADES DEBEN SER EXCLUSIVAMENTE DEBIDAS A LOS ATOMOS PESADOS MÉTODO: 1. Preparación de, al menos, un derivado (Hg, Au, Pt, U, Sm...Xe,Kr). 2. Toma de datos de difracción para nativa y derivados. 3. Aplicación de función de Patterson y obtención coordenadas del metal. 4. Refinamiento parámetros átomo pesado y cálculo ángulos de fase. 5. Cálculo de mapas de densidad electrónica de la proteína.

15 MIR Derivado de Sm de Hal2 INCONVENIENTES: 1. Errores en |F PH | y |F P |. 2. No isomorfismo (4% < d min ). 3. Desorden en sitios minoritarios. 4. Escalado.

16 MAD VENTAJAS: 1. No hay problemas de isomorfismo. 2. Da mejores resultados a alta resolución. DISPERSIÓN ANÓMALA: Espectro de fluorescencia de un cristal de proteína con Se-Met. Para determinadas E del haz de Rayos X se produce un fenómeno de absorción y resonancia de electrones de capas internas. Modificación de la contribución del átomo pesado a cada spot de difracción (efecto anómalo). F(h k l)  F (-h, -k, -l) (  |F| anom ) 2 (x, y, z) anom

17 MÉTODO: 1. Inclusión de dispersores anómalos en la estructura. CategoríaDispersor Anómalo Metaloproteínas metales de transiciónFe, Cu, Zn, Mn otros metalesCa, Mo Remplazamiento de metales Ca2+, Mg2+ por LantánidosTb,Ho,Yb Zn por Mercurio Hg Complejos con átomos pesados derivados comunesPt,Au,Hg,Pb,W,U Compuestos con “cluster”Ta,W Proteínas modificadas Selenometionina o selenocisteínaSe TelurometioninaTe nucleótidos Bromados o IodadosBr, I 2. Medida del espectro de absorción. 3.Toma de datos de difracción de rayos X a diferentes longitudes de onda. 4. Medida de los pares de Friedel { (h k l ), (-h, -k -l)} INCONVENIENTES: -Medidas cuidadosas. -Uso de diferentes Radiación sincrotrón. MAD

18 |F CAL | +  CAL SÍNTESIS DE FOURIER {(x y z)}  (x y z) = 1/V  |F OBS | exp {-2  i (hx+ky+lz)+ i  CAL } F=  f j exp{2  i(hx+ ky+ lz)} |F OBS | DATOS EXPERIMENTALES Cristalógrafo MR - MIR - MAD

19 MODELO INICIAL ERRORES GRAVES MEJORA DE LAS FASES REFINAMIENTO MODELADO MODELO FINAL - Gráfico - Experiencia Cristalógrafo - Elimina errores más graves - Analítico. -Datos estereoquímica

20 REFINAMIENTO El modelo cambia para minimizar las diferencias entre los datos experimentales y los obtenidos a partir del modelo. E T = E xray + E empirical E xray =  {|F OBS | - k |F CAL |} 2 E empirical =  bonds K b (b-b o ) 2 +  angles K  (  -  o ) 2 +  torsional K  (1+ cos(n  -  ))+  VDV +...... TIPOS: - Mínimos cuadrados. - Gradiente conjugado. - Dinámica Molecular. TT U(x) x CONTROL: - Estereoquímica. - Factor de desacuerdo, R. R   {|F OBS | - k |F CAL |}/  {|F OBS | }

21 MAPA DE DENSIDAD ·ELECTRÓNICA El mapa de densidad electrónica depende de la resolución. BAJA: 5Å MEDIA: 3Å ALTA: 1.7Å

22 TRAZADO DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA

23 MODELO FINAL CON ESFERA DE SOLVATACIÓN

24 VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL Plot de Ramachandran

25 1. R y R free (R < 0.2, R free =R+(5-10)% ) 2. Estereoquímica del modelo frente a la ideal. 3. Distribución de factores térmicos. 4. Ajuste en densidad. VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL

26 ....................................................................... ATOM 1 CB ASP 9 -31.877 64.364 9.711 1.00 37.33 6 ATOM 2 CG ASP 9 -31.408 65.701 9.162 1.00 41.83 6 ATOM 3 OD1 ASP 9 -32.254 66.612 8.998 1.00 44.35 8 ATOM 4 OD2 ASP 9 -30.189 65.848 8.918 1.00 43.38 8 ATOM 5 C ASP 9 -32.205 62.836 7.764 1.00 28.21 6 ATOM 6 O ASP 9 -31.876 63.319 6.683 1.00 30.25 8 ATOM 9 N ASP 9 -33.860 62.883 9.631 1.00 33.61 7 ATOM 11 CA ASP 9 -32.913 63.691 8.811 1.00 31.98 6....................................................................... MODELO ESTRUCTURAL FINAL FICHERO DE COORDENADAS “pdb” Coordenadas:(x, y, z) Factor de ocupación Factor térmico (B)

27 INFORMACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL TIPOS: - ESTÁTICA {x y z}: - Estruct. terciaria. Dominios Funcionales - Estruct. Cuaternaria. - DINÁMICA {B}: - Flexibilidad funcional en bucles. -Termoestabilidad. INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA. INTERACCIONES PROTEINA-LÍPIDOS. INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: - Reconocimiento. - Estabilización. - Procesos Catalíticos. SUPERFICIES MOLECULARES: - Determinación de zonas accesibles. - Importancia del Potencial Electrostático.

28 ESTRUCTURA CUATERNARIA Concanavalina de Cannavalia Brasiliensis La diferente agregación de los monómeros en la estructura cuaternaria provoca variaciones en su función biológica. G CMBE FEBS Letters 405, 114-118 (1997)

29 INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA S-Adenosilmetionina Sintetasa El centro activo se crea por el empaquetamiento de dos monómeros. G CMBE (1999) MONÓMERO TETRÁMERO Sitio de unión a metionina

30 ESTRUCTURA CUATERNARIA HAL3at El empaquetamiento cristalino es función del estado de agregación biológico de la proteína. G CMBE (1999) Trímero (unidad fisiológica) Empaquetamiento Cristalino.

31 FLEXIBILIDAD FUNCIONAL EN BUCLES Lipasa Fungica Candida A Lid G CMBE (1999)

32 TERMOESTABILIDAD G CMBE Mutante Termoresistente TR1  B= B NAT -B MUT Un puente salino provoca la estabilización del plegamiento. PROTEINS 33: 567-576 (1998)

33 INTERACCIONES PROTEINA-LIPIDOS G CMBE Complejo Ternario Lipasa-Colipasa-Micela La unión del complejo Lipasa-Colipasa a una micela de sal biliar es necesaria para su activación in vivo. EMBO Journal Vol. 16, 18, 5531-5536 (1997) El anclaje del complejo proteico a la micela se produce mediante residuos polares en la superficie micelar y mediante residuos hidrofóbicos y aromáticos en el interior de la micela.

34 INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO Complejo ternario Hal2p-Metal-sustrato Hal2p hidroliza PAP a AMP. Es imprescindible la presencia de metales divalentes. EMBO Journal (1999). En prensa G CMBE Hal2p es inhibida por Li y Na. CLAVE para la tolerancia salina ya que es esencial para la vida celular. SITIO DE UNIÓN A METALES SITIO DE UNIÓN AL SUSTRATO

35 SUPERFICIES MOLECULARES Aspartato Descarboxilasa (PanD) El centro activo es inaccesible. Se propone movimiento relativo de protómeros para permitir la entrada del sustrato. Nature Struct. Biol. (1998). STRUCTURE (1999) G CMBE PanD descarboxila L-Asp para producir Ala. La superficie molecular sugiere interacción con otros componentes celulares. Barril beta doble 

36 INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: RECONOCIMIENTO G CMBE  -Glucosidasa de Bacillus polymyxa El Glu 405 puede acomodar Glucosa y Galactosa al estabilizar el OH(4) ecuatorial o axial. J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998) Glu405

37 INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: PROCESOS CATALÍTICOS Lipasa pancreática La apertura del flap en el dominio catalítico permite la entrada del sustrato. J. BIOL. CHEM. Vol.271, 18007-18016 (1996) La estabilización del sustrato se realiza mediante residuos hidrofóbicos y la hidrólisis mediante la tríada catalítica (Ser, His, Asp).

38 SUPERFICIES MOLECULARES ZONAS ACCESIBLES Mutante FNR-E301A PROTEINS. (1999). G CMBE La mutación provoca la creación de una cavidad que modifica el proceso de reoxidación de la enzima. Od La nueva cavidad permite el acceso del O molecular y la formación intermedio de la reacción flavin- hidroperóxido.

39 SUPERFICIES MOLECULARES POTENCIAL ELECTROSTÁTICO Mutante FNR-R264E BIOCHEMISTRY. (1998). G CMBE El potencial electrostático creado por los residuos cargados puede determinar la interacción entre proteína-proteína o proteína-ligando. Líneas de campo en la FNR. Sección del potencial en la FNR.

40 SUPERFICIES MOLECULARES POTENCIAL ELECTROSTÁTICO Octámero BglA G CMBE El Glu306 en la superficie del octámero podría servir como “atractor” de azucares en BglA. J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998)