Bioquímica del Cobalto

Presentación del tema: "Bioquímica del Cobalto"— Transcripción de la presentación:

1 Bioquímica del Cobalto
Vitamina B12 Clara Oliver Duran Albert Fiol Ibars Bioinorgánica Curs

2 Índice Introducción Co en medios biológicos Vitamina B12
Estructura y derivados Papel biológico Bibliografía

3 Introducción Cobalto (Co)
Poco abundante (25 ppm de la corteza terrestre) Muy disperso (+ de 200 menas de ↓ interés) Grupo 9 Configuración electrónica: [Ar]3d74s2 EO relevantes: III, II y I Poco abundante (representa solamente 25 ppm de la corteza terrestre, lo que lo convierte en el elemento de transición menos abundante después del escandio). Debido a esta baja concentración de cobalto en la corteza terrestre la presencia del mismo en la coenzima b12 no deja de ser sorprendente y sugiere un valor funcional único de esta coenzima. Estas menas de cobalto suelen asociarse con menas de niquel, cobre o plomo, por lo que actualmente se obtiene como subproducto de la metalurgia de estos elementos.

4 Química de coordinación
Co (III) ↑ cantidad de complejos (especialmente con L = N-dadores) 𝑪 𝒐 𝑰𝑰 +𝒏𝑳+𝒐𝒙𝒊𝒅𝒂𝒏𝒕𝒆 ⇄ 𝑪 𝒐 𝑰𝑰𝑰 𝑳 𝒏 En presencia de catalizadores adecuados (ej. carbón activo) Oxidantes: H2O2 y O2 𝐶𝑜 𝐻 2 𝑂 𝑒 − ⇄ 𝐶𝑜 𝐻 2 𝑂 𝐸 0 =1,83 𝑉

5 Química de coordinación
Co (III) 𝐶𝑜 𝑁 𝐻 𝑒 − ⇄ 𝐶𝑜 𝑁 𝐻 𝐸 0 =0,108 𝑉 𝐶𝑜 𝐶𝑁 − + 𝑒 − ⇄ 𝐶𝑜 𝐶𝑁 − 𝐸 0 =−𝟎,𝟖 𝑽 Complejos Co (III): Oh y de bajo espín → diamagnéticos Inertes

6 Química de coordinación
Co (II) Complejos de coordinación variados en estequiometría pero más lábiles y menos numerosos. Oh de alto espín También Td Escasos ejemplos con geometría plano-cuadrada Generalmente, no se oxidan espontáneamente para dar Co (III).

7 Química de coordinación
Co (I) Forma complejos con ligandos aceptores π. También se conocen casos L macrocíclicos N-dadores (formas reducidas vitamina B12). Características: Especies ↑ reductoras Nucleófilas M pentacoordinado

8 Co en medios biológicos
Cobalto → funciones biológicas específicas Enzimas cuya coenzima es un derivado de vit. B12 Mutasas del esqueleto carbonado (glutamato mutasa) Eliminasas (diol deshidratasa) Aminomutasas (L-β-lisina mutasa) Ribonucleótido reductasa Intercambiadores de grupos Me: síntesis de metionina (metionina sintasa) biometilación de M Coenzima B12 A continuación dividiremos las biomélculas que contienes cobalto en dos apartados diferenciados: el que hace referencia a las enzimas que utilizan como coenzima derivados de la vitamina B12 y las metaloproteínas que contienen el metal. Cofactor metilcobalamina

9 Co en medios biológicos
2) Metaloproteínas que contienen cobalto Mayoría → de algas y bacterias Intervienen en: Hidrólisis (prolidasa) Activación H2O (nitrilo hidratasa) Isomerización (glucosa isomerasa) Bromación (bromoperoxidasa) En este segundo grupo se incluyen biomoléculas que no dependen de derivados de la vitamina B12.

10 Co en medios biológicos
Farmacocinética del Co: Hidrólisis inicial y unión a glucoproteína → complejo Absorción: Íleon (duodeno) Distribución: Por la sangre (transportador) → hígado Excreción (poco importante): Bilis ≈ 1 mg Co Un adulto contiene ≈ 1 mg Co 1 10 parte = derivados de vitamina B12 Los derivados de la vitamina contenidos en la dieta sufren un proceso de hidrólisis en el medio ácido estomacal y se separan de las proteínas que los acompañan. Una vez liberados de estas proteínas se unen a una glucoproteína que recibe el nombre de factor intrínseco de Castle, que protege la vitamina o derivado de la degradación que pudieran causarle enzimas digestivas presentes en el tracto gastrointestinal, y se forma un complejo. Éste es absorbido por las vellosidades del íleon en el duodeno, que es la última parte del intestino delgado, en presencia de calcio. Una vez absorbido, el cobalto es transportado por la transcobalamina II a través del torrente circulatorio hasta el hígado donde se almacena. Cabe comentar que la excreción se da a través de la bilis aunque constituye una etapa poco importante de la farmacocinética del metal ya que únicamente se excreta una pequeña cantidad. La mayor parte se reabsorbe en el intestino lo que provoca que las necesidades de reposición sean mínimas aunque no por ello menos necesarias, siendo suficiente una ingesta del orden de 1 ug al día.

11 Co en medios biológicos
A escala celular El Co puede entrar usando sistema de transporte del Mg2+ (poco selectivo) Indicios de mecanismos de transporte específicos (Komeda et al, 1997) Una vez en el citoplasma = probable sistema de gestión del Co (incorporación a los derivados de la vit B12 ) Mecanismos de transporte específicos: proteínas que permiten que el Co penetre en el interior celular pero discriminen otros metales como el Ni. En el citoplasma es plausible que exista algún sistema de gestión específico para el cobalto. Esta posibilidad se sostiene por el hecho de que el cobalto se incorpore a los derivados de la vit B12 a pesar de que el cinc (II) supuestamente debería enlazarse mejor si compitieran en condiciones de equilibrio iónico libre.

12 Vitamina B12 Descubrimiento Estudios acerca de la anemia perniciosa
(↓ nº de eritrocitos de gran tamaño) Causaba: degeneración del SN y muerte 1926, G. Minot, W. Murphy y G. Whipple: dieta a base de ↑ hígado crudo → aislamiento del factor antianemia perniciosa → tratamiento Anemia perniciosa, enfermedad inicialmente incurable, que consiste en una disminución de los glóbulos rojos y un crecimiento anómalo de los que permanecen, también denominada anemia megaloblástica. Conducía a una degeneración irreversible del sistema nervioso y muerte a los poco años si no se aplicaba un tratamiento adecuado. En 1926, dos médicos de Harvard, Gerre Minot y William Murphy, descubrieron el beneficio sobre dicha enfermedad de una dieta a base de grandes cantidades de hígado crudo. Al ser la anemia perniciosa una enfermedad sin cura en ese momento, en seguida se procedió a aislar el principio activo contenido en el hígado que motivaba esa mejora. A ese principio activo se le denominó factor antianemia perniciosa. Por este descubrimiento recibieron el premio nobel de medicina en el año 1934. La preparación de extractos acuosos de este factor antianemia perniciosa y su posterior administración por vía intravenosa mejoró la calidad de vida e incluso curó algunos pacientes que padecían esta enfermedad. Curiosamente esta mejora dejó estancado el avance en la investigación de dicho principio activo ya que el número de afectados por la enfermedad disminuyó así como la presión social por conseguir mejoras en el tratamiento. Todo ello condujo a que se dejara de intentar identificar cuál era dicho factor que curaba la enfermedad.

13 Vitamina B12 1948. Folkers et al (Merck Lab.) aislamiento sustancia roja: Vitamina B12 1957. D. Hodgkin. Identificación definitiva de composición y estructura (rayos X) y determinación de la estructura de la coenzima B12 (1962) Posteriormente, se encontró otra forma activa: metilcobalamina. Hubo que esperar hasta dos décadas más tarde para que Folkers en el laboratorio Merck en EEUU consiguiera asilar el supuesto principio activo que era efectivo frente a la anemia perniciosa. Después de procesar toneladas de hígado de vacuno aislaron una sustancia roja a la que denominaron vitamina B12. El propio equipo de Folkers inició el análisis estructural pero no fue hasta 1957 cuando Dorothy Hodgkin identificó de forma definitiva la composición y estructura de la vitamina B12 mediante difracción de rayos X. De hecho, fue la propia Dorothy quien determinó la estructura de la coenzima B12 (adenosilcobalamina). Los trabajos sobre estos sistemas le valieron el premio nobel de Química en 1964. Posteriormente se demostró la existencia de otra forma activa en medios biológicos que sustituye el resto adenosilo por un grupo metilo, de ahí que se denomine metilcobalamina. Veamos las correspondientes estructuras de estos compuestos.

14 Estructuras Estructura vitamina B12 Estructura coenzima B12
Metilcobalamina En esta figura vemos el esqueleto básico de las estructuras tanto de la vitamina B12, como de la coenzima B12 así como de la metilcobalamina que acabamos de nombrar. La única diferencia radica en la naturaleza de X, en el caso de la vitamina B12 es cianuro, en el caso de la coenzima X es la 5’-desoxiadenosilo y en el caso de la metilcobalamina es un grupo metilo. Vayamos una por una a analizar estas estructuras. Estructura vitamina b12: El macrociclo que rodea al cobalto se denomina corrina. Se asemeja a una porfina, la cual vimos en el primer tema, que ha perdido un puente –CH= entre dos de los anillos pirrólicos. La diferencia entre un macrociclo y otro es que la coordinación no es tan regular en las corrinas y lo que es más importante, en éstas se incrementa de manera significativa la capacidad para resistir la acción reductora de centros metálicos cuando adoptan EO muy bajos lo que permite que la corrina sea capaz de estabilizar la unión Co-C (lo que no es capaz de hacer un macrociclo de porfirina). Dicho de otra forma, las corrinas tienen la conjugación precisa para estabilizar derivados naturales con una sola unión Co-C. Por lo que respecta a los radicales propionamida periféricos de la corrina, se cree que proporcionan a la molécula su carácter hidrofílico permiten unir las coenzimas con el apoenzima o con las proteínas de transporte. Además su geometría prácticamente planar genera un campo muy fuerte en ese plano, haciendo muy reactivas la quinta y sexta posición de coordinación. Una de las cadenas laterales de uno de los anillos pirrol de la corrina incluye un enlace alfa-azúcar-nucleótido con un resto 5,6-dimetilbenzimidazol que bloquea si nos fijamos la sexta posición de coordinación del cobalto. Es habitual el uso de la nomenclatura base on y base off para hacer referencia a cuando este ligando se encuentra unido o ausente respectivamente. De hecho durante los procesos catalíticos que utilizan derivados de la vitamina b12 este resto suele ser desplazado adoptando la forma base off. Estructura coenzima B12: Observamos el aspecto más peculiar que es la presencia de una unión Co-C, la cual dilucidó Hodgkin mediante estudios de rayos X. ésta en lugar de cianuro como en la vitamina B12 presenta un grupo 5’-desoxiadenosilo que se une al cobalto a través del resto –CH2. Constituye un verdadero compuesto organometálico natural. La distancia cobalto-carbono es de unos 2,05 À (angstroms) y el ángulo Co-C-C es de 130º. Es habitual el uso del término cobalamina para referirse a estos compuestos: cianocobalamina para hacer referencia a la vitamina y adenosilcobalamina para referirse al coenzima.

15 Otras cobalaminas AdoCbl y MeCbl → Hidroxocobalamina (HO-Cbl) o aquocobalamina (H2O-Cbl) A menos que se tomen medidas estrictas para evitar la luz, las formas biológicamente activas, adenosilcobalamina y metilcobalamina, evolucionan rompiendo la unión Co-C y sustituyéndola por la unión Co-OH o Co-OH2, lo que da lugar a la hidroxocobalamina o aquocobalamina. Estas son los precursores a escala celular de las formas catalíticas.

16 Vitamina B12 y coenzima B12 Distribución cobalaminas en sangre
La sangre de una persona adulta contiene aproximadamente un 66 % de metilcobalamina y un 34 % de adenosilcobalamina, hidroxocobalamina y aquocobalamina en plasma. Mientras que en los glóbulos rojos, más de la mitad corresponden a la adenosilcobalamina, el 25 % a la hidroxocobalamina o aquocobalamina y el 10 % a la metilcobalamina. Las reacciones enzimáticas que son dependientes de la vitamina B12 realmente utilizan la adenosilcobalamina o la metilcobalamina por lo que no se conoce ninguna función de la vitamina en sí misma.

17 Funciones de la Vit. B12 La Vitamina B12 tiene diversas funciones, entre las cuales pueden destacarse algunas: 1) Participa en la síntesis proteica (MetAP) 2) Es importante su papel en la formación de glóbulos rojos (el déficit está relacionado con anemias) 3) Clave para el correcto funcionamiento del sistema nervioso central 4) Evita la acumulación de homocisteína (MeCbl) 5) Participa en el metabolismo de ácidos grasos (AdoCbl) 6) Ayuda al correcto funcionamiento del sistema inmunológico. 2) Juntamente con la vit B9 (ácido fólico), clave para la formación del grupo hemo. 3 ) Participa en la síntesis de neurotransmisores. Está relacionado con la metionina, en la síntesis de la cual interviene la VitB12. Además, es necesaria para el cuidado de la vaina de mielina (capa de lipoproteína que recubre y aísla los axones, lo cual permite la correcta transmisión de los impulsos nerviosos). 4) Una acumulación de homocisteína aumenta el riesgo de padecer patologías cardiovasculares.

18 Papel biológico Importancia de la rotura del enlace Co-C
Derivados de la vit. B12 como coenzimas en catálisis enzimática Los AdoCbl y MeCbl están implicados en 15 (12+3) procesos enzimáticos. Solamente 2 (1+1) en mamíferos: a) Síntesís de metionina a partir de homocisteína (MeCbl) Isomerización de metilmalonil-CoA para dar succinil-CoA (AdoCbl) Metaloproteínas de cobalto (Metionina aminopeptidasa, MetAP) - Se necesita una elevada labilidad de este enlace para alcanzar una velocidad de ruptura catalítica. - 3 modos de romper el enlace. El elegido seguramente depende del ligando trans al enclace Co-C, de la naturaleza del sustrato y del potencial redox implicado.

19 Papel biológico 1.A) Metilcobalamina, MeCbl.
Actúa como cofactor junto a la enzima metionina sintasa. Transferencia de un grupo metilo la la homocisteína: Veamos, en primer lugar, el rol biológico que desempeñan los derivados de la vit.B12, AdoCbl y MeCbl. - La MeCbl, como ha dicho anteriormente mi compañera, es un derivado de la Vit.B12 donde el grupo ciano de ésta se sustituye por un metilo. La única reacción enzimática en la que interviene en mamíferos es en la síntesis de metionina (aminoácido no esencial). Metionina sintasa es una proteïna monomérica de 137 kDa, con 4 módulos, donde el situado en el extremo N-terminal es el que enlaza con la homocisteína. Contiene un Zn(II) tetraédricamente coordinado con 3 Cys y 1 H2O, la cual desplaza para enlazar con homocisteína. Le siguen el módulo que enlaza con el agente metilante, el que enlaza con la MeCbl y por último aquel donde se fija el SAM (S-adenosilmetionina) - Formalmente, el grupo metilo transferido proviene de la rotura heterolítica del enlace Co-C, que produce Co(I) + carbocatión. En realidad, el metilo proviene del 5-metiltetrahidrofolato, y MeCbl es solo un intermediario.

20 Papel biológico 1.A) Metilcobalamina, MeCbl.
MeCbl se encuentra en forma de base off. Reacción vía adición oxidante: - MeCbl se encuentra en forma “base off”. En consecuencia, en la posición axial-alfa se encuentra unido un N imidazólico que pertenece a un resto Hys (Hys-759), la cual forma parte de un fragmento de restos de aa, que incluye también, además, una Asp (Asp-757) y una Ser (Ser-810). - La propuesta más extendida para el mecanismo de esta reacción es vía adición oxidante: RS= homocisteína, MeCbl tiene 1 carga negativa deslocalizada sobre los restos de la cadena de aa. Una segunda parte de la reacción (que no aparece en el esquema) es la regeneración de MeCbl a partir de la desprotonación de la Hys. Así pues, desplazando protones, el sistema que aparece en la figura cataliza la metilación/desmetilación del Co (se modifica la fuerza de unión Co-C)

21 Papel biológico 1.B) Adenosilcobalamina, AdoCbl.
AdoCbl cataliza isomerizaciones. Es necesaria la formación del radical adenosilo (rotura homolítica enlace Co-C) Amplísima diferencia de labilidad del enlace en cuestión entre las 2 situaciones. 3 posibles mecanismos para explicar el aumento de la labilidad del enlace en presencia de apoenzima y sustrato. Se cambia un H de un C por el sustituyente del C vecino (intercambio 1,2) El proceso se inicia con la rotura homolítica del enlace Co-C. Entalpía de disociación Co-C sin sustrato: baja pero no suficiente para tener velocidades de reacción catalíticas (K del orden de 10^(-9) s^(-1)).EN PRESENCIA DE SUSTRATO: k del orden de 10^(2) s^(-1) (factor de 10^9) 1: alteración de la posición del ligando dmbim-> modificación de la distancia Co-N ->cambia la basicidad del grupo dmbim. Favorecerán el proceso grupos atractores de e-. 2: Ya de por si hay repulsión estérica entre el grupo adenosilo y los sustituyentes más externos del anillo de corrina (evidencia: ángulo Co-C-C=130º en vez de 109,5º). Si se pone un ligando trans que doble el anillo de corrina hacia arriba (el anillo tiene cierta flexibilidad) -> aproximación sustituyentes-adenosilo -> más tensión-> la rotura del enlace estabilizaría, favorecería, la situación. 3: modificación estructural del apoenzima (reducción espacial del centro activo) al enlazarse al sustrato, entonces el adenosilo ha de separarse -ruptura del enlace Co-C- porque, literalmente, no cabe. (es la única con evidencias experimentales)

22 Papel biológico 1.B) Adenosilcobalamina, AdoCbl.
En mamíferos i bacterias cataliza la transformación de ácido metilmalónico en ácido succínico, reacción clave en los mamíferos en la degradación de ácidos grasos de cadena impar. También interviene en la reacción CoA. Como ha dicho mi compañera al inicio, existen distintas clases de enzimas dependientes de AdoCbl (existen diferencias, como por ejemplo que unas están en forma base off y otras en base on, aunque el tipo de reacción catalizada es la misma) Además, en las bacterias también tiene un papel importante: interviene en la fermentación de piruvato a propinoato, reacción catabólica al igual que en el caso de los mamíferos.

23 Papel biológico 1.B) Adenosilcobalamina, AdoCbl.
El mecanismo de reacción es el siguiente: Puede observarse la reacción global atendiendo a la especie inicial y a la resultante de la etapa 4.

24 Papel biológico 1.B) Adenosilcobalamina, AdoCbl.
El enzima (en mamíferos) es un dímero, con dos centros activos: uno enlaza al sustrato (previamente unido a CoA) y el otro al coenzima B12 AdoCbl (presente en forma de base off). Varias evidencias experimentales refuerzan el mecanismo de reacción ya visto. Evidencias: 1) Transferencia de H estereoespecífica, y además no se intercambia con H del disolvente. 2) El H transferido pasa por la posición 5’ de AdoCbl (se ha observado marcando esta posición con deuterio o tritio) 3) Se ha demostrado por espectroscopia que el Co cambia de estado de oxidación durante la reacción. 4) EPR (espectroscopia de resonancia paramagnética, responde a electrones desapareados) ha demostrado la presencia de radicales.

25 Papel biológico 2) Metaloproteínas de cobalto
Son enzimas que no dependen de las cobalaminas vistas con anterioridad. Analizaremos la metionina aminopeptidasa (MetAP), metaloproteína que interviene en la reacción de hidrólisis del resto aminoacido del extremo N-terminal –Met- en la síntesis proteica (dado que siempre sufren modificaciones). Una de las más estudiadas es la de la Escherichia coli : monómero de 29,3 kDa con el centro activo situado entre los dos dominios que la forman. Además de a Co(II), el apoenzima puede unirse también a Zn(II) o Mn(II). El interés por esta metaloproteína surgió al comprobarse que la enzima humana es el blanco de la fumagilina y derivados (molécula que inhibe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, proceso relacionado con determinadas enfermedades como el desarrollo de tumores o la artritis reumatoide).

26 Papel biológico En el centro activo se sitúan 2 Co(II), separados 3,2 A por un resto Asp-108, el cual los une, juntamente con un Glu-235 y un hidroxilo. Coordinados no de manera equivalente por restos aminoácidos de las cadenas que los rodean: el Co “nº1” tiene una coordinación bipiramidal trigonal, mientras que el Co “nº2” se coordina formando un octaedro distorsionado a su alrededor. Además de a Co(II), el apoenzima puede unirse también a Zn(II) o Mn(II). El interés por esta metaloproteína surgió al comprobarse que la enzima humana es el blanco de la fumagilina y derivados (molécula que inhibe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, proceso relacionado con determinadas enfermedades como el desarrollo de tumores o la artritis reumatoide).

27 Bibliografía Formato papel:
J. S. Casas, V. Moreno, A. Sánchez, J. L. Sánchez, J. Sordo. “Química Bioinorgánica” M. Vallet, J. Faus, E. García-España, J. Moratal. “Introducción a la Química Bioinorgánica” Enrique J. Baran. “Química Bioinorgánica” Formato electrónico día 2-III-2014) (consultada día 17-III-2014) (consultada día 17-III-2014) (consultada día 17-III-2014) Apuntes de la asignatura Química Biológica, de 3r curso de GQUI. (consultada día 28-III-2014)

28 ¿Alguna pregunta?