Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas

Presentación del tema: "Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas"— Transcripción de la presentación:

1 Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas
Isabel García Luque Departamento de Microbiología Universidad de Sevilla

2 Infecciones asociadas a dispositivos médicos
Aumento considerable de dispositivos médicos. Alta incidencia de infecciones. Infecciones persistentes que responden poco/mal a tratamientos convencionales. Resistencia/ tolerancia a los antimicrobianos.

3 Infecciones asociadas a dispositivos médicos.
Implante nº /año Infecciones Mortalidad Catéter intravascular <0,1-7% 15-20% Sonda uretral 5-10% Shunts LCR 80.000 10-15% Marcapasos 60.000 0-3% 2% Válvulas protésicas 1-5% 34% Prótesis articulares <1-2% 2,5% Implantes dentales 15%

4 Infecciones asociadas a dispositivos médicos
Device Prevalent causative pathogens Principal Secondary Central venous catheters CoNS S. aureus, enterococci, Candida spp., K. pneumoniae, P. aeruginosa. Urethral catheters E. coli Candida spp., CoNS, E. faecalis, P. mirabilis. Mecanical heart valves S. aureus, Streptococcus spp., GNB, enterococci, diptheroids. Ventricular assist devices S. aureus, Candida spp., P. aeruginosa. Coronary stents S. aureus CoNS, P. aeruginosa, Candida spp. Neurosurgical ventriclar shunts Staphylococci Streptococcus spp., Corynebacterium, GNB. Peritoneal dialysis catheters P. aeruginosa, other Gram-negative spp., Candida spp., Orthopedic prostheses S. pneumoniae, Streptococcus spp., P. acnes. Fracture-fixation devices S. aureus, Propionibacterium spp., Corynebacterium, Endotracheal tubes Enteric GNB P. aeruginosa, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Inflatable penils implants S. aureus, enteric GNB, P. aeruginosa, Serratia spp., fungi. Breast implants E. coli, peptostreptococci, C. perfringens, P. acnes. Cochlear implants P. aeruginosa, Streptococcus spp., N. meningitidis, fungi.

5 ¿Cómo actuar?: Retirada/cambio del dispositivo.
Tratamiento antimicrobiano prolongado a altas dosis. Reintervención difícil. Única opción: tratamiento antimicrobiano. Costes elevados

6 Actividad antimicrobiana – biocapas bacterianas
Huésped Microorganismo. Antimicrobiano. DISPOSITIVO MÉDICO

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8 Biocapas bacterianas:
Comunidad de microorganismos, incluidos dentro de una matriz extracelular, que se encuentran adheridos a una superficie o en una interfase y que poseen un estado metabólico diferente del de las bacterias de vida libre. J.W.Costerton. The Biofilm Primer

9 Formación de las Biocapas. Adherencia
Fase inicial: inespecífica, reversible. Interacciones a larga distancia (>150 nm). Fuerzas de Van der Waals Gravitación Interacciones electrostáticas Hidrofobicidad Enlaces de hidrógeno Enlaces covalentes Interacciones iónicas Hidrofobicidad Moléculas bacterianas (adhesinas, GPS) Fase secundaria: específica, irreversible. Interacciones a corta distancia (<3 nm).

10 Formación de las Biocapas.
Una vez adheridas, las bacterias comienzan a multiplicarse hasta que se desarrolla la biocapa madura.

11 La estructura de la biocapa no es homogénea.

12 En el proceso de desarrollo de la biocapa, se establece una comunicación entre las bacterias (quorum sensing). “Mecanismo bacteriano de comunicación intercelular controlando la expresión génica en función de la densidad celular”.

13 Eficacia de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas.
Penetrar a través de la densa matriz de la biocapa. Mantener su actividad bactericida: En las diferentes condiciones microambientales. Frente a bacterias de crecimiento lento. Presentar baja tasa de desarrollo de resistencias

14 Resistencia de las biocapas bacterianasa los antimicrobianos
Resistencia innata. Mecanismos adicionales, diferentes a los de las bacterias planctónicas. CMB biocapas >> CMB planctónicas. Las bacterias recuperan rápidamente su sensibilidad cuando se liberan de la biocapa.

15 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:
Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida). Alteraciones en el metabolismo bacteriano: Baja tasa de crecimiento Heterogeneidad fenotípica Resistencia inducida por los biomateriales

16 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:
Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida). Pseudomonas aeruginosa: alginato- imipenem y tobramicina. Staphylococcus aureus: slime - glicopéptidos. Actividad dependiente de la estructura /composición química de la biocapa y tamaño/composición química del antimicrobiano.

17 Estudios de Permeabilidad
1 MH agar. 2,4 Membranas de policarbonato. 3 Biocapas. 5 Disco de antimicrobiano

18 Permeabilidad de CIP, AMC, FOS y SXT en biocapas de P. aeruginosa y E
Permeabilidad de CIP, AMC, FOS y SXT en biocapas de P. aeruginosa y E. coli 50% 50% 50% 50%

19 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:
Alteraciones en el metabolismo bacteriano: Tasa de crecimiento reducida: Pseudomonas aeruginosa /betalactámicos. Staphylococcus epidermidis/ ciprofloxacino. Diferentes condiciones microambientales: ácido/básicas, aeróbicas/anaeróbicas P. aeruginosa / tobramicina. Mecanismos convencionales de resistencia a los antimicrobianos.

20 Mecanismo de resistencia
Especies bacterianas Antimicrobianos Impermeabilidad de las biocapas a los agentes antimicrobianos P. aeruginosa Aminoglucósidos, Betalactámicos S. epidermidis S. aureus Vancomicina, Teicoplanina Tasa alterada de crecimiento E. coli Betalactámicos Fluoroquinolonas El microambiente de las biocapas afecta a la actividad antibacteriana Característica general de las biocapas Aminoglucósidos, Macrolidos, Tetraciclinas Mecanismos de resistencia expresados en bacterias planctónicas Azitromicina, Betalactámicos, Tobramicina Elementos genéticos de transferencia horizontal Enterobacteriaceae Betalactámicos, Aminoglucósidos

21 Mecanismos de resistencia de las biocapas bacterianas:
Resistencia inducida por biomateriales: P. aeruginosa y látex siliconizado: La actividad de las carbapenemas disminuye en presencia de este biomaterial. (J Med Microbiol 1997). Relacionado con las OMPs (pérdida de oprD2). (Antimicrob Agents Chemother. 1999) Inducida por el Zn liberado al medio. (Antimicrob Agents Chemother. 2003)

22 OMPs de P. aeruginosa: Efecto del zinc
MC. Conejo et al.; Antimicrob Agents Chemother. 2003

23 CzcCBA: Bomba de expulsión responsable de la co-resistencia a carbapenemas y metales pesados.
Perron K. et al. J Biol Chem 2004; 279:

24 “Comparison of biofilm-associated cell survival following in vitro exposure of meticillin-resistant Staphylococcus aureus biofilms to the antibiotics clindamycin, daptomycin, linezolid, tigecycline and vancomycin”. Smith et al. Int J Antimicrob Agents. 2009

25 Limitaciones estudios in vitro:
Formación proceso complejo: Muchos factores. Difícil reproducir in vitro. Resultados controvertidos. Cautela a extrapolar in vivo.

26 Métodos de estudio in vitro
Modelos estáticos: Formación de las biocapas: Placas de microdilución. Incubación de segmentos. Exposición de la biocapa al antimicrobiano Ventajas: Muchos antimicrobianos, diferentes concentraciones. Inconvenientes: Modelo estático, tiempos cortos, poliestireno

27 Efecto de daptomicina sobre la formación de biocapas
MRSA MSSA Efecto de daptomicina sobre la formación de biocapas >70% >75% MRSE MSSE 70-90% >90% VISA 80% Roveta et al. Int J Antimicrob Agents 2008

28 Adherencia bacteriana a biomateriales plásticos
Bacterias adheridas x 105/cm2 Catéter S. aureus S. epidermidis E. coli P. aeruginosa Latex siliconizado 27 ±3 18 ±2 19 ±2 24 ±3 PVC 42 ±5 23 ±3 41 ±4 Teflon 11 ±1 7 ±0,4 3 ±0,1 10 ±1 Poliuretano 15 ±1 4 ±0,6 9 ±0,1 13 ±1 Vialon 7 ±1 5 ±0,3 4 ±0,2 López et al. J. Med Microbiol

29 Métodos de estudio in vitro Modelos dinámicos
Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar. Dispositivo de Robbins

30 Modelo dinámico Sevilla device
Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar. Utilizar segmentos de catéteres.

31 Poliuretano. Biocapas de 24 h

32 Acero inoxidable. Biocapas de 96h.

33 Actividad de antimicrobianos frente a microorganismos Gram positivos resistentes

34 Daptomicina / Biometales
Cepas: Staphylococcus epidermidis ATCC (ica +: productora de slime). CMI: Daptomicina 0.5 mg/L Vancomicina 2.0 mg/L Biomateriales: Segmentos de catéteres de poliuretano (3 cm; 7 french). Discos de acero inoxidable 316L (diámetro: 8 mm).

35 Poliuretano. Biocapas de 24 h
* * * p<0.05 comparada con vancomicina

36 Acero inoxidable. Biocapas de 96h.
* * * * p<0.05 comparada con Vancomicina

37 Figura 2. Microscopía electrónica de barrido de las biocapas de 72 horas de S. epidermidis sobre catéteres de poliuretano usando el dispositivo diseñado por nuestro grupo sin antimicrobiano (a) y expuesto a 7.5mg/L de daptomicina (b) a) b)

38 Linezolid / Biometales
Actividad comparativa de linezolid y vancomicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.

39 Linezolid / Biometales
Actividad de linezolid y vancomicina asociados a rifampicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.

40 Nuevas estrategias frente a las biocapas bacterianas
Impedir la formación de la biocapa: Bloqueando la adherencia: Biomateriales impregnados con biocidas o antimicrobianos. Moléculas antisentido que silencien los genes involucrados en la adherencia Inhibidores del quorum sensing. Adhesión inicial Adherencia Colonización Transporte de masas Interacciones electrostáticas Van der Waals Adhesina-receptor Interacciones hidrofóbicas Formación de Biocapa BIOMATERIAL Quorum Sensing

41 Nuevas estrategias terapéuticas frente a las biocapas bacterianas
Eliminar la biocapa formada: Métodos físicos: corriente eléctrica de baja intensidad, ultrasonidos Terapia fotodinámica (PDT)

42 Material y métodos Cepas: Actividad de hipericina (0.04-500 uM):
Efecto del tiempo de incubación con hipericina en la actividad fotodinámica antimicrobiana frente a biocapas estafilocócicas. Sofía Ballesta1, Isabel García1, Yolanda Gilaberte2, Antonio Rezusta3, Álvaro Pascual1,4. Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla1. Unidad de Dermatología, Hospital San Jorge, Huesca2. Departamento de Microbiología, Hospital Universitario Miguel Servet. Universidad de Zaragoza. Zaragoza3. Unidad de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Hospital Universitario Virgen Macarena. Sevilla4. Material y métodos Cepas: S. aureus ATCC y ATCC (productora y no productora de slime) S. epidermidis ATCC (productora de slime). Actividad de hipericina ( uM): Bacterias en suspensión: 5 min de preincubación y dosis de luz de 8 J/cm2 (lámpara LED 602±10 nm; intensidad 24 mW/cm2, 10 min tto). Biocapas de 24 horas formadas sobre placas de poliestireno: Diferentes tiempos de preincubación 30 J/cm2 (30 min tto)

43 Resultados Bacterias en suspensión: Preincubación: 5 minutos.
Dosis de luz: 8 J/ cm2 Cinco minutos de preincubación con hipericina 1µM fueron suficientes para eliminar los estafilococos en suspensión.

44 Resultados Biocapas estafilocócicas: Preincubación: 5 minutos.
Dosis de luz: 8 J/ cm2

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46 Conclusiones Hipericina mostró un efecto bactericida dosis- dependiente frente a las biocapas de S. aureus y S. epidermidis. La actividad de Hiperericina frente a las biocapas de S. aureus y S. epidermidis fue tiempo de preincubación y concentración dependientes La reducción en la supervivencia bacteriana fue menor en la cepa de S. aureus productora de slime que en la no productora. El efecto de la hipericina sobre las biocapas de S. epidermidis fue similar al observado en las biocapas de S .aureus no productor de slime.

47 Actividad fotodinámica de hipericina asociada a antimicrobianos frente a biocapas de Staphylococcus aureus Cepas: S. aureus ATCC y ATCC (productora y no productora de slime) Preincubación de las biocapas de 24 horas formadas sobre placas de poliestireno con hipericina ( µM) Dosis de luz: 30 J/cm2 (lámpara LED 602±10 nm; intensidad 24 mW/cm2, 30 min tto). Incubación durante 24 h con: 10mg/L Linezolid+/- 3 mg/L Rifampicina

48 * Clara relación entre tiempo preincubación, concentración y actividadpreinc 24 h: 0,125um 3.3 log. Preincub inferiores máxima red 2 log: 6 h 1 uM 20 min y 2 h 64UM 7,00 5,83 5,41 4,68 4,14 3,73 0,072 0,083 0,001 0,000 VS CONTROL 0,042 0,052 VS Atbco SIN HYP 0,030 0,016 Vs hyp

49 No bactericida. Maxima reducción 2. 3 log 20 250um 6,94 5,20 4,88 5,36
4,24 4,28 0, 0, 0, 0, 0, VS CONTROL 0, 0, VS Atbco SIN HYP 0, 0, Vs hyp

50 Conclusiones La actividad fotodinámica de hipericina fue similar a la mostrada por linezolid solo o asociado a rifampicina frente a biocapas de S. aureus. La actividad de hipericina asociada a linezolid o a linezolid más rifampicina fue mayor que la mostrada por hipericina sola. The antimicrobial photodynamic activity of HYP against staphylococcal biofilms was lower than that shown against planktonic bacteria. At non-toxic concentrations (≤ 1 µM), longer preincubation times (24 hours) and higher fluence (30 J cm-2) were required to induce a photodynamic bactericidal effect on biofilms. HYP concentrations ≥ µM were bactericidal, with a reduction of 3.5 log in the surviving bacteria, against the weak biofilm-producer S. aureus strain. Regarding the moderate biofilm-producer S. aureus strain, only a reduction around 2 log was obtained. HYP 1 µM showed a bactericidal effect, with a reduction of 3.2 log, against S. epidermidis, a strong biofilm-producer strain It is concluded that the HYP antimicrobial photodynamic activity against staphylococcal biofilms was species-dependent and related, in S. aureus, with the biofilm production. Our results point out that HYP may be a potential photosensitizer for the inactivation of both planktonic bacteria and biofilms on the surface of medical devices, and other surfaces, accessible to visible light.

51 Actividad fotodinámica de hipericina frente a cepas clínicas de Staphylococcus aureus
Bacterias en suspensión: Supervivencia SAMR SAMS bacteriana 11 cepas REDUCCIÓN 0,12 µM 3 LOG 0,25 µM TOTAL

52 Supervivencia bacteriana
Biocapas : Supervivencia bacteriana HYP REDUCCION LOG µM MR MS 2 1,08 ± 0,35 1,05 ± 0,27 4 1,30 ± 0,31 1,09± 0,30 8 1,49 ± 0,42 1,26 ± 0,28 16 1,79 ± 0,47* 1,20 ± 0,30