UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO.

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1 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA BASES MOLECULARES DEL ACOPLAMIENTO INTERCELULAR EN EL SINCITIO PANGLIAL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TUTELADO  Autor: Ilaria Fasciani  Directores: Dr. Luis C.Barrio y Dr. Daniel González Nieto  Tutor: Dra. Marisol Fernández-Alfonso  Lugar de realización: Unidad de Neurología experimental. Departamento de investigación. Hospital Ramón y Cajal Hospital Ramón y Cajal Junio 2009 Junio 2009

2 COMUNICACIÓN INTERCELULAR A TRAVÉS DE CANALES M1M2M3M4 E1E2 NT CT CL Conexina (Cx) Conexón (hemicanal) Canal Intercelular 6 Cx’s 2 hemicanales

3 ASTROCITOSOLIGODENDROCITOS Cx30 Cx26 Cx43 Cx46.6 Cx32 Cx31.3 ENFERMEDAD DE PELIZAEUS- MERZBACHER SINCITIO PANGLIAL PMLD (Cx46.6) WT

4 ARN 5’ AUG ACC AAC AUG AGC TGG AGC TTC..TGA 3’ 12 3 4 STOP Met ThrAsnTrpSer Phe NT de Cx26

5 OBJETIVOS   1. Caracterización de los canales de la Cx-46.6 humana:   Identificación del sitio de iniciación de la traducción del mRNA   Estudio de las propiedades de regulación por voltaje y por pH   2. Determinación de las propiedades de los canales implicados en el acoplamiento astrocito-oligodendrocito.

6 METODOLOGÍA 3) ENSAYO EN EL SISTEMA DE EXPRESIÓN DE LOS OOCITOS DE XENOPUS Canales intercelulares 1) CLONAJE Y MUTAGENESIS 2) TRANSCRIPCIÓN IN VITRO 4) INMUNODETECCIÓN pBSXG PCR Stu1 5) CONDUCTANCIA INTERCELULAR Gj (DOBLE FIJACIÓN DE VOLTAJE) “LIGACIÓN” 6) pH i 580 nm 630 nm pH i 7.23 pH i 5.73 ROI-2 ROI-1 ROI-2 PROTEÍNA TOTAL PROTEÍNA SUPERFICIE C-SNARF STOP ATG HCX46.6 GENÓMICO + Met4 Met1&4 Met4

7 ( g/ l)  [RNA]  Conductancia Intercelular (  S) (24 h.a.p) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2.01.00.50.10.050.0250.005 N=3 n=8 N=4 n=21 N=10 n=48 N=4 n=13 N=3 n=16 N=3 n=13 N=3 n=14 N=4 n=13 N=5 n=13 Met4 Met1&4 1) IDENTIFICACIÓN DEL SITIO DE INICIACIÓN de la Cx46.6. ARN Met1&4 5’ AUG ACC AAC AUG.......TGA 3’ 440aa 1 2 34 STOP Met ThrAsn ARN Met4 5’.........................AUG.......TGA 3’ 437aa 0.0e+02.5e+55.0e+57.5e+51.0e+6 0 10 20 30 40 50 60 Condutancia Intercelular (  S) (48 h.a.i., 24 h.a.p) 0.025 0.05 0.5 0.1 Met1&4 Met4 Cx46.6 EN SUPERFICIE (UA; 48 h.a.i.) 0.0e+05.0e+51.0e+61.5e+6 0.0e+0 2.5e+5 5.0e+5 7.5e+5 1.0e+6 Cx46.6 EN SUPERFICIE (UA) Met4 0.05 Met1-4 1.0 Met1-4 0.5 Met4 0.025 TOTAL DE Cx46.6 (UA) Met1&4 (0.1) 100kDa control Met4 (0.1) 52kDa BC 500 Met1-4 HCx46.6 Met4 HCx46.6 CONTROL 0 100 200 300 400 52 kDa 0 100 200 300 400 500 Met1-4 HCx46.6 Met4 CONTROL

8 V j I j 100 mV +120 -120 1 s 50 nA 100 V j I j mV +120 -120 1 s nA -120-80-4004080120 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 V j G j -120-80-4004080120 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 V j G j Met1&4 Met4 Met1&4/Met4 V j I j 100 mV +120 -120 1 s 100 nA -120-80-4004080120 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 G j V j 2. PROPIEDADES DE LOS CANALES DE LA Cx46.6 2.1. REGULACIÓN POR VOLTAJE

9 CANALES OLIGODENDROCITARIOS, ASTROCITARIOS Y OLIGODENDROCITARIOS-ASTROCITARIOS CANALES ASTROCITO-OLIGODENDROCITO

10 Met1&4/hCx43 Met4/hCx43 hCx43 V j I j 1 s 40 nA 100 mV +120 -120 j V j I +120 100 mV -120 1 s nA 100 LOS CANALES ASTROCITARIOS y ASTROCITARIOS- OLIGODENDROCITARIOS 100 mV j V +120 50 nA I j 1 s -120

11 CONCLUSIONES   1) Los estudios realizados para identificar cuál es la metionina iniciadora en la Cx46.6 indican que el mRNA se transduce a partir del primer triplete AUG presente en el extremo 5’ de su secuencia. Como consecuencia de ello, el número de residuos aminoacídicos de la Cx46.6 es de 440.   2) El triplete de aminoácidos Met-Thr-Asn presente en el extremo 5’ del dominio amino-terminal de la Cx46.6 es un importante determinante molecular de las caracteristicas funcionales del canal y de las propiedades de regulación por voltaje y por pH.   3) La Cx46.6 oligodendrocitaria es capaz de formar canales con la Cx43 astrocitaria, formando unas uniones de tipo rectificador en función del voltaje. Esta rectificación se origina como consecuencia de la diferencia de permeabilidad entre los hemicanales que constituyen los canales de Cx46.6-Cx43 e implica unidireccionalidad para la difusión de iones y moléculas.