UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

Presentación del tema: "UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE"— Transcripción de la presentación:

1 UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA Selección de actinomicetos aislados de suelos paperos de la provincia de Loja antagónicos a Phytophthora infestans (Mont.) de Bary y Rhizoctonia solani Kühn, mediante ensayos in vitro y pruebas de invernadero en Solanum tuberosum L. PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA ANDREA CAROLINA MEDINA RODRÍGUEZ Alma Koch, MC Ing.-Mat. Pedro Romero Directora Codirector Marzo, 2014

2 Caracterización de factores de supresividad presentes en suelos andinos a Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Alma Koch, MC. Soledad Benítez, PhD. Carla Garzón, PhD. Ing. Claudia Díaz. Ing. Carolina Mogrovejo. Ing. Zayda Morales. Ing. Gabriela Orquera. Ing. Daniela Villamarín. 2009; 2011.

3 INTRODUCCIÓN S. tuberosum Papa Importancia Enfermedades
-Alimento de la población -Apoyo económico Enfermedades “Lancha de la papa” (P. infestans) “Rhizoctoniasis” (R. solani) Control: Agentes químicos, prácticas culturales, semillas certificadas, selección genética, entre otros. ALTERNATIVA Control biológico: Hongos y bacterias antagonistas. Reducción de peligros ecológicos y de salud pública.

4 INTRODUCCIÓN Lancha o tizón tardío de la papa. P. infestans
Lesiones necróticas P. infestans Lancha o tizón tardío de la papa. Reino: Chromista Pared celular tiene celulosa. Micelio sin septos. Reproducción sexual y asexual. Lesiones necróticas 40 X Esporangios

5 INTRODUCCIÓN R. solani (fase asexual)
Rhizoctoniasis o costra negra de la papa. Thanatephorus cucumeris (fase sexual) Poco común. Micelio en etapa juvenil incoloro, en etapa madura amarillo. GA: Anastomosis: fusión de hifas. Papa con esclerocios Cultivo 40 X

6 INTRODUCCIÓN ACTINOMICETOS Actinomiceto Cultivo 100X Procarióticos
Formadoras de esporas. ACTINOMICETOS Procarióticos Bacterias Gram +. Células individuales, filamentos ramificados y micelios. Aerobios o anaerobios. Varios mecanismos de acción. Beneficiosos y patógenos. Actinomiceto Cultivo 100X

7 OBJETIVOS Objetivo general:
Seleccionar actinomicetos aislados de suelos paperos de la provincia de Loja antagónicos a Phytophthora infestans (Mont.) de Bary y Rhizoctonia solani Kühn, mediante ensayos in vitro y pruebas de invernadero en Solanum tuberosum L.

8 OBJETIVOS Objetivos específicos: Activar y mantener los actinomicetos.
Mantener las cepas de Phytophthora infestans. Aislar Rhizoctonia solani de tubérculos de papa. Realizar pruebas de inhibición de actinomicetos contra P. infestans y R. solani a nivel in vitro y seleccionar los actinomicetos. Determinar la actividad antagónica de actinomicetos frente a R. solani a nivel de invernadero.

9 MATERIALES Y MÉTODOS Activación de actinomicetos FASE DE LABORATORIO
Cepas liofilizadas Hidratación: Agua peptonada estéril. 1 hora. Siembra: Gota directa en caldo glicerol. Incubación: 25°C-10 días 150 rpm Resiembra: YGA Activación de actinomicetos

10 Tubérculos infectados
MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento de Rhizoctonia solani Tubérculos infectados Lavado con agua estéril. Hipoclorito de sodio 3% Desinfección Alcohol 70% Cloranfenicol Secado Siembra en PDA modificado.

11 MATERIALES Y MÉTODOS Prueba dual de actinomiceto vs. P. infestans
-YGA. -Incubación 20°C - 22 días. Zona de inhibición P. Infestans ESPE1 Prueba dual de la cepa de actinomiceto Loja 9 vs P. infestans ESPE1

12 MATERIALES Y MÉTODOS Prueba dual actinomiceto vs R. solani 1 A.-
YGA: Actinomiceto incubación 76 horas 20°C 1 B.- R. solani incubación 4 días 20°C Actinomiceto Zona de inhibición R. solani Prueba dual de la cepa de actinomiceto Loja 23 vs R. solani

13 Prueba dual en caja Petri
MATERIALES Y MÉTODOS Prueba dual en caja Petri Control P. infestans Prueba dual

14 Foliolos de papa variedad “uvilla”.
MATERIALES Y MÉTODOS Pruebas de antagonismo en folíolos de papa: Actinomicetos vs. P. infestans Foliolos de papa variedad “uvilla”. Inoculación con 1 mL de solución de actinomicetos 2 g actinomiceto/ 9 mL de agua. Después de 2 h los folíolos se inocularon con una gota de 40 µL de P. infestans CIP84 2x104 esporangios/mL. Se incubó por 5 días.

15 MATERIALES Y MÉTODOS Ensayo de invernadero : Actinomicetos vs R. solani en sustrato Preparación de inóculo de actinomicetos: 11 g de biomasa húmeda Preparación inóculo R. solani: Semillas de avena Inoculación de sustrato con R. solani: 20 g del inóculo Se colocó un tubérculo por maceta Inoculación de sustrato con actinomicetos: 24 h para que se establezcan

16 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FASE DE LABORATORIO Aislamiento de cepa de Rhizoctonia solani. Hifa de R. solani teñida con azul de lactofenol. Vista microscópica aumento 40X. Cultivo purificado de R. solani en medio PDA en caja Petri.

17 Activación de las cepas de actinomicetos liofilizadas
RESULTADOS Y DISCUSIÓN FASE DE LABORATORIO Activación de las cepas de actinomicetos liofilizadas Cepa de actinomiceto de Loja L18 activada en medio YGA. Tinción Gram de la cepa de actinomiceto de Loja L19. Vista microscópica aumento 100X.

18 Pruebas duales en caja Petri entre actinomicetos vs R. solani.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN FASE DE LABORATORIO: Pruebas duales en caja Petri Pruebas duales en caja Petri entre actinomicetos vs R. solani. Pruebas duales en caja Petri entre actinomicetos vs P. infestans ESPE1.

19 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diseño experimental: Pruebas duales en caja Petri P. infestans Diseño completamente al azar; 6 repeticiones por tratamiento. Kruskal Wallis p<0,0001 Trat. N Medias D.E. H p Categorías L13 6 65.55 3.38 77.64 <0.0001 L18 9 A L14 16.2 L40 L19 48.79 6.29 23.83 B L21 75.33 4.48 L6 25.25 L22 6.53 L34 34.7 L23 66.95 2.1 L31 41.33 C 62.76 4.89 46.75 D 5 59.22 5.79 49.67 L37 73.18 4.24 50.17 L9 65.17 E L41 72.07 68 L48 77.65 2.5 69 49.72 7.9 74.92 71.6 3.71 81 Promedios de inhibición: 3 cepas: 16.2%. 7 cepas: 48.79% %. 5 cepas: 73.96%.

20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diseño Experimental: Pruebas duales en caja Petri R. solani Diseño completamente al azar; 6 repeticiones por tratamiento. Kruskal Wallis p<0,0001 Trat. N Medias D.E. H p Categorías L13 6 64.81 3 82.6 <0.0001 L18 4.5 A L14 16.79 2.2 8.67 B 14.41 L40 15.83 C L19 43.41 6.1 L9 28.67 D L21 67.67 6.2 L34 30.33 L22 48.17 9.1 L6 35 L23 45.79 1.8 40.33 E L31 80.03 3.1 44.83 40.09 4.4 45.17 L37 100 L48 52.5 F 24.39 5.3 65.25 G L41 83.83 9 67.25 52.92 7.2 78.17 42.94 79 38.66 87 Promedios de inhibición: 3 cepas: % 9 cepas: % 3 cepas: %

21 Folíolo de papa infectado por P. infestans
RESULTADOS Y DISCUSIÓN FASE DE LABORATORIO: Antagonismo en folíolos de papa Infección P. infestans Folíolo de papa infectado por P. infestans

22 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FASE DE LABORATORIO: Antagonismo en folíolos de papa Pruebas de antagonismo en folíolos de papa variedad “uvilla”: Actinomicetos L21 y L48 vs P. infestans CIP84.

23 Pruebas de supervivencia de actinomicetos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN FASE DE LABORATORIO: Antagonismo en folíolos de papa Pruebas de antagonismo en folíolos de papa variedad “uvilla”: actinomicetos L18 vs P. infestans CIP84. Pruebas de supervivencia de actinomicetos.

24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FASE DE LABORATORIO: Antagonismo en folíolos de papa Porcentajes de inhibición de las cepas de actinomicetos de la provincia de Loja L18, L21 y L48 contra P. infestans en pruebas antagónicas con folíolos de papa de la variedad “uvilla”.

25 Plántula de papa infectada por R. solani
RESULTADOS Y DISCUSIÓN FASE DE INVERNADERO: Pruebas de antagonismo en invernadero para R. solani Infección R. solani Plántula de papa infectada por R. solani

26 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FASE DE INVERNADERO: Pruebas de antagonismo en invernadero para R. solani En los tres tratamientos L37, L41 Y L18 R. solani colonizó las plantas de papa variedad “superchola”. Brotes de tubérculo de papa variedad “superchola” afectado por R. solani.

27 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FASE DE INVERNADERO: Pruebas de antagonismo en invernadero para R. solani Aislamiento de R. solani a partir de tejido infectado de plantas utilizadas en el ensayo de antagonismo en invernadero. Pruebas de supervivencia R. solani y actinomicetos.

28 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FASE DE INVERNADERO: Pruebas de antagonismo en invernadero para R. solani Porcentajes de infección de R. solani en plantas de papa variedad “superchola”.

29 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FASE DE INVERNADERO: Pruebas de antagonismo en invernadero para R. solani Porcentajes de emergencia de plantas de papa variedad “superchola” utilizadas para las pruebas de antagonismo con actinomicetos y R. solani en invernadero.

30 CONCLUSIONES: Las cepas de actinomicetos presentaron porcentajes similares de inhibición a tres diferentes cepas de P. infestans. Las cepas de actinomicetos tuvieron diferencias significativas (p<0.0001) en la capacidad de inhibir el crecimiento de P. infestans y R. solani en las pruebas duales en caja Petri. Las cepas de actinomicetos L21 y L48 estuvieron en la primera categoría de inhibición a P. infestans y L18 en la última categoría de inhibición, según la prueba de Kruskal Wallis. Las cepas de actinomicetos L37 y L41 estuvieron en la primera categoría de inhibición a R. solani y L18 en la última categoría de inhibición, según la prueba de Kruskal Wallis.    Los actinomicetos L21 y L48 inhibieron en 100% a P. infestans en folíolos de papa y el actinomiceto L18 inhibió en 0%. Las cepas de actinomicetos L37, L41 y L18 antagónicas a R. solani in vitro no presentaron inhibición al patógeno en los ensayos de invernadero.

31 RECOMENDACIONES: Caracterizar molecularmente las cepas de actinomicetos. Optimizar la obtención del inóculo de actinomicetos.  Seguir con estudios de antagonismo en invernadero contra P. infestans para en un futuro poder hacer un bioproducto que controle al patógeno.

32 Agradecimientos: Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE
Colaboradores Alma Koch Kaiser, M.Sc. Ing.-Mat. Pedro Romero Lcda. Jessica Maisincho. Soledad Benítez, PhD. Carla Garzón, PhD. Ricardo Oliva, PhD. Centro Internacional de la Papa André Devaux, PhD. Jorge Andrade-Piedra, PhD. Ing. Israel Navarrete Ing. Marcelo Vinueza Ing. Arturo Taipe Yolanda Yépez

33 ¡¡GRACIAS!!