TRANSFORMACIÓN. Fred Griffith 1928, sus estudios los realizó en Streptococcus pneumoniae Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células.

Presentación del tema: "TRANSFORMACIÓN. Fred Griffith 1928, sus estudios los realizó en Streptococcus pneumoniae Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células."— Transcripción de la presentación:

1 TRANSFORMACIÓN

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3 Fred Griffith 1928, sus estudios los realizó en Streptococcus pneumoniae Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células S “principio transformante”

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5 El Principio transformante es DNA

6 TRANSFORMACIÓN CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE UN DNA EXÓGENO Puede ser NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso) ARTIFICIAL (INDUCIDA)

7 TRANSFORMACIÓN ¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformación Algunas hipótesis que no son excluyentes….. I.Para la diversidad genética ( por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos ) II. Para la reparación de DNA III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo

8 SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN ¿existe DNA libre en todos los ambientes, es estable?

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10 TRANSFORMACIÓN NATURAL, las bacterias más estudiadas son ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente ETAPA 2: Procesamiento del DNA Unión Importe Recombinación GRAM + Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis GRAM - Neisseria gonorrhoeae Haemophilus influenzae El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS

11 Etapa 1: Desarrollo de un estado competente ¿Qué es una célula competente? Estado fisiológico inducible Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural: Limitación en los nutrientes Mitomicina C Alta densidad celular Temperatura, pH La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C

12 La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia

13 Transporte DNA en Gram + ANTES se debe formar el pseudopili que atraviesa la pared celular 1.Unión del DNA a la superficie por interacción con proteínas (++) del pseudopili 2. Unión a receptor: ComEA (no es secuencia específica) 3. Fragmentar y degradar la cadena que no se transporta 4. Se ha encontrado una endonucleasa en membrana ComEC: canal en la membrana ComFA: unión a ATP

14 Transporte DNA en Gram + Se ha sugerido que el reconocimiento es secuencia específica: (5´GCCGTCTGAA-3´) Pili tipo IV: Sistema de secreción tipo II El pili debe cruzar la membrana interna, el espacio periplásmico y la membrana externa

15 Una vez que ingresó el DNA de cadena sencilla ¿qué ocurre dentro de la célula? ¿DE MANERA NATURAL es fácil intercambiar plásmidos entre bacterias por transformación? ¿es más fácil por conjugación?

16 TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generar organismos transgénicos

17 TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,

18 PLÁSMIDOS

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20 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA Medio LB + KANAMICINA Escherichia coli

21 En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado competente de una bacteria? 1. Tratamiento químico 2. Electroporación

22 E. coli Preparar células competentes de E. coli 3 mL medio Luria Incubar toda la noche a 37°C E. coli A= 0.6 – 0.8 a 600 nm

23 5000 r.p.m. 5 min 4°C 3 mL NaCl Resuspender 5 mL CaCl 2 Resuspender E. coli Preparar células competentes de E. coli Incubar 20 min 2500 r.p.m 7 min CÉLULAS COMPETENTES

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25 Plásmido 1 hr 42°C 70 s Inmediatamente en hielo 1 mL medio SOC Incubar a 37°C con agitación por 45 min LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO

26 CÉLULAS COMPETENTES PLÁSMIDO: DNA EXÓGENO Buffer TE, CaCl 2 y PLÁSMIDO

27 Al final de la transformación

28 Esquema general

29 A nivel molecular

30 Electroporación

31 Utilizaremos el plásmido pET-TEM Sitio múltiple de restricción Origen de replicación Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa

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33 Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos: La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos. La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: 1.Adenilación de grupos hidroxilo. 2.Fosforilación de grupos hidroxilo. 3.Acetilación de grupos amino. ENZIMA INACTIVADORAAMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO: Gentamicina adeniltransferasaGentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina. Gentamicina acetiltransferasaNetilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Kanamicina acetiltransferasaNetilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Neomicina, Kanamicina fosfotransferasa Gentamicina A, Neomicina, Kanamicina

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35 Células transformantes Células no transformantes Medio Luiria + KANAMICINA

36 ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina