Transformación Ingreso a la célula de DNA presente en el medio

Presentación del tema: "Transformación Ingreso a la célula de DNA presente en el medio"— Transcripción de la presentación:

1 Transformación Ingreso a la célula de DNA presente en el medio
Bacterias Levaduras Células de animales (mamíferos) Células vegetales

2 Bacterias (Escherichia coli)
Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma Plásmidos manipulados por ingeniería genética: vectores de clonamiento ►Origen de replicación ►Gen de resistencia a antibiótico (marcador de transformación) ►Sitio de clonamiento (“polylinker”) Transformación (transfección) llevada a cabo por: Permeabilización con CaCl2, choque de temperatura Electroporación Utilidad ►Biblioteca de cDNA - sitio de clonamiento asociado a gen de -galactosidasa ►Expresión de proteínas recombinantes - sitio de clonamiento asociado a operón lac (expresión inducible por IPTG) y elemento que facilite purificación (ej. His-tag)

3 Colonias azules : fragmento clonado Colonias blancas : sin fragmento
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) -galactosidasa H HO Producto azúl galactosa Colonias azules : fragmento clonado Colonias blancas : sin fragmento - IPTG → expresión bloqueada + IPTG → expresión

4 Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
Plásmidos → del tipo lanzadera (“shuttle”) ► Origen de replicación en E. coli ► Gen de resistencia a antibiótico (selección en E.coli) ► Origen de replicación en levadura ● 2  ● ARS (secuencia de replicación autónoma) ► Marcador de selección metabólico YACs → Cromosomas artificiales de levadura ► Secuencias teloméricas ► Secuencias centroméricas ► ARS (secuencia de replicación autónoma)

5 Vectores y marcadores de selección en levaduras
(YAC)

6 otros organismos Transformación llevada a cabo por:
1. Generación de esferoplastos, permeabilización con CaCl2, choque de temperatura 2. Tratamiento con acetato de litio y PEG, choque de temperatura Utilidad ► Expresión de proteínas recombinantes que no se pliegan correctamente en E. coli ► Clonamiento de fragmentos muy grandes para el estudio de genomas complejos (YACs) ► Genes de levadura → similitud con genes de animales y plantas superiores Levadura útil como modelo para probar función de genes de otros organismos

7 Manipulación de genes por recombinación homóloga

8 Eliminación (KO) de genes cromosómicos

9 “Plasmid shuffle” Estudio de función de genes
KO TPK1, TPK2, TPK3 “Plasmid shuffle” Estudio de función de genes mutantes o genes foráneos

10 Interacción de proteínas por ensayo de doble híbrido

11 Animales Genes en: ► Fragmentos de DNA
► Vectores tipo plásmido con elementos virales ► Virus Fragmentos y vectores que no se replican → Transitoria Permanente (integración) Vectores que se replican y virus → Genomas extracromosómicos independientes Partículas virales

12 Transformación llevada a cabo por:
Microinyección DNA precipitado con fosfato de calcio (endocitosis) Electroporación Liposomas Infección viral Utilidad ► Expresión de proteínas recombinantes ► Estudio de la expresión de genes en entorno natural (promotor + gen reportero) ► Estudio de la función de los genes en entorno natural ● Expresión ● Silenciamiento (antisentido)

13 Marcadores de selección

14 Ejemplo 1: Transformación con
fragmentos de DNA

15 Ejemplo 2: Transformación con
vectores

16 Localización de HBZ-GFP y HBZ-SI-GFP en células COS7
Murata et al. J. Virol. 80(5): (2006) Vector: pcDNA3/HBZ-GFP pcDNA3/HBX-SI-GFP

17 Ejemplo 3: Transformación combinada
fragmentos de DNA y virus

18 Ejemplo 4: Transformación combinada
fragmentos de DNA y virus

19 Ejemplo 5: Transformación con virus (retrovirus)