Polimorfismos de los receptores adrenérgicos en la IC

Presentación del tema: "Polimorfismos de los receptores adrenérgicos en la IC"— Transcripción de la presentación:

1 Polimorfismos de los receptores adrenérgicos en la IC
Miguel A. Torralba Cabeza

2 Aspectos a tratar Concepto de Gen y Polimorfismo.
Los Receptores adrenérgicos. Los SNPs de los receptores adrenérgicos. Métodos de estudio de la correlación entre Genotipo/Fenotipo de los receptores adrenérgicos.

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7 Aspectos históricos KARY B. MULLIS: “PCR”
Gregor Mendel:”leyes de la Herencia” A. Kossel: “Ácidos Nucleicos” Hershey y Chase: “ADN es material genético” Watson y Crick: “estructura doble hélice” <<aislamiento de 1º genes humanos>> Science: 1ª secuenciación genoma(SV40) KARY B. MULLIS: “PCR” Organización del Genoma Humano Genoma de Drosophila M. COLLINS VENTER 1866 1910 1950 1953 1975 1978 1986 1988 2000 2001 SECUENCIA GENOMA HUMANO

8 Concepto de Gen Un gen es la unidad básica de herencia de los seres vivos. Desde el punto de vista molecular, un gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN, que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica: Proteinas. ARN. Al conjunto de Genes de una especie se le denomina Genoma

9 El Genoma humano Sólo 1% del DNA se transcribe
Organización en exones e intrones: SNPs: 1/1250 bp (2,1millones). Microsatélites. ESTs Science: 16 February 2001 (291). CAUSAS DE LA COMPLEJIDAD DEL GENOMA HUMANO: Un GEN es capaz de construir diferentes productos en un proceso que es llamado ayuste alternativo Existen miles de modificaciones químicas para fabricar proteínas así como del repertorio de mecanismos que regulan este proceso.

10 El Genoma humano Ajuste alternativo Genómica: es el
estudio de los genes: estructura función Ajuste alternativo Guttmacher A et al. N Engl J Med 2002; 34:

11 Mecanismos por los que un Gen puede dar lugar a múltiples productos génicos
TRANSCRIPCIÓN PROCESAMIENTO TRADUCCIÓN TRANSLACIÓN Proteolisis DNA RNA mRNA PROTEINA Modificación Post-transduccional Regulación transcripcional Procesamiento de Intrones. Edición de mRNA Poliadenilación Regulación tranduccional Compartimentalización Pero … además de la transcripción del RNA se pueden dar muchas otras modificaciones de los productos génicos por: -transcripción de 1 gen (estímulo vs inhibicón) Modulación del procesamiento del RNAm y Poliadenilación. O bien puede existir una regulación traduccional. O en el proceso de maduración de la proteina en el caso de que esto sea necesario. POR LO TANTO, SI BIEN ES MUY INTERESANTE EL ESTUDIO DE LOS GENES, lo realmente interesante es el estudio de la PROTEÓMICA: De expresión (dónde se expresa la proteina). Estructural (dónde cumple su función). Función. De expresión Proteómica: es el estudio a gran escala de los productos génicos de un Genoma Estructural Funcional

12 De cada gen, los humanos tenemos generalmente dos copias, una heredada de cada progenitor. Los científicos han encontrado cerca de genes (más del 10% de los genes del genoma humano) que pueden sufrir 'variaciones en el número de copias' (CNV) de unas regiones determinadas. Estos segmentos del genoma están formados por unos pares de bases cada uno. Hasta ahora se creía que cada persona difería de otra en un millón de los más de millones de nucleótidos que componen el genoma humano. Sin embargo, se ha demostrado que entre dos personas hay más de 20 millones de nucleótidos de diferencia, que se agrupan en regiones del genoma.

13 MODELO EPIGENÉTICO Gosden R et al. NEJM 2007; 356 (7) Figure 1. A Model of the Interaction between Genetic and Epigenetic Factors in Disease. Common diseases — including neuropsychiatric and rheumatologic diseases and cancer — may involve a combination of genotype and epigenotype. In addition to the classic view that genetic variation and environment affect phenotype, the genetic and epigenetic model of common diseases suggests that the epigenotype modulates genetic effects. The epigenotype, in turn, is affected by the environment, the epigenotype of the parents, age, and the genotype at loci that regulate DNA methylation and chromatin. Las enfermedades comunes comprenden una combinación entre el genotipo y el epigenotipo. Además de la visión clásica de que la variación genética y el medio ambiente afectan al fenotipo, el modelo epigenético sugiere que el epigenotipo modula la acción genética y éste a su vez es afectado por el ambiente, el epigenotipo de los padres, la edad y la secuencia de los loci que regulan la metilación del DNA y la cromatina. El modelo epigenético sugiere que el epigenotipo modula la acción genética y éste a su vez es afectado por el ambiente, el epigenotipo de los padres, la edad y la secuencia de los loci que regulan la metilación del DNA y la cromatina.

14 Los Polimorfismos Son variantes alélicas que ocurren en la población con una frecuencia > 1%. El alelo más común o con actividad enzimática mayor se denomina “wild type”. Las variantes con actividad más baja o inexistente son las “mutaciones”

15 MUTACIONES Guttmacher et al. NEJM 2002; 347 (19)

16 Los Polimorfismos TERMINOLOGÍA INTERNACIONAL
GEN “GBA”

17 La Insufiencia Cardiaca es un síndrome muy complejo, donde existen gran cantidad de mecanismos implicados en la Transducción de Señales

18 Science; 5 Oct 2007: 510

19 Adaptado de Harrison: principios de Medicina Interna 16ª Edición
PROLIFERACIÓN CELULAR Angiotensina II Catecolaminas Endotelina TNF-a GH IGF Cardiotropina-I Estiramiento mecánico La transmisión de señales se lleva a cabo mediante mensajeros FIBROSIS Angiotensina II Endotelina Aldosterona TGF- b APOPTOSIS TNF-a Fas FACTORES CONTRARREGULADORES ANP Bradicinina Óxido Nítrico BNP Adaptado de Harrison: principios de Medicina Interna 16ª Edición

20 La molécula fundamental en la transducción de señales extracelulares es el RECEPTOR

21 Señalización asociada a RECEPTORES DE MEMBRANA

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23 (II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G EN LA INSUFICIENCIA CARDIACA: el Receptor B1
RECEPTOR B1: aumenta contractilidad e HVI mediante Adenilato ciclasa. ¿HAN PENSADO VDS LO QUE HACEN CUANDO INHIBEN UN RECEPTOR ALFA Y BETA? Respuesta rápida Hunter J et al. N Engl J Med 1999; 341:

24 (II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G
VÍA ADENILATO CICLASA SÍNTESIS PROTEICA Respuesta lenta

25 Receptores adrenérgicos alfa y Beta
B1 y B2: aumentan contractilidad e HVI mediante Adenilato ciclasa. B2: activa la protein kinasa mitógena y contrarregulación. B3: activa la NO sintasa. a1 postsinapsis: activa la protein kinasa mitógena ->HVI. a2 presinapsis: regulación de la liberación de Noradrenalina. El exceso de expresión de la angiotensina II sobre los receptores AT1 constituye una de las piedras angulares de desarrollo de HTA y remodelado cardiaco vascular y renal. IECA, bloqueadores de receptor AT1 y B bloqueantes mejoran dichas condiciones fisiopatológicas. El recpetor AT1 es un tipo de molécula denominada G proteina acoplada a receptor que incia una serie de señales que afectan a la función celular, fundamentalmente regulando la movilización del Ca. Se ha observado en pacientes y ratones con HTA y dislipemia la existencia de monocitos en la luz de los vasos que expresan gran cantidad de recpetores para la angiotensina II. Estos monocitos son los precursores de los macrófagos endoteliales, que a través de este mecanismo adquieren un aumento de facilitaría la adhesión al endotelio la capacidad para generar angiotensina 2 mediante la ACE, así como incremento de la actividad del factor XIIIa. Este factor XIIIa catalizaría la formación de recpetores AT1 diméricos que estarían implicados no sólo en el aumento de la capacidad de señal sino en la mala respuesta a tratamiento farmacológico con IECA e inhibidores de los AT1 Hayar RJ et al. N Engl J Med 2002; 347:

26 ¿CUÁLES SON LOS GENES QUE SE TRANSCRIBEN POR ESTOS MECANISMOS?
Pro-BNP, pro-ANP. Codificantes estructuras sarcoméricas: MYH6, MYH10. Implicados en la Apoptosis: CCL2, PHLDA1, SNCA. Implicados en el Crecimiento celular: FRZB, SFRP4, SPOCK, CTFG. Implicados en el control del Ciclo celular: G0S2, ETV5, RARRES1. Genes implicados en la Respuesta Inmune: CFHL3, FCN3, CCL2, S100A8. ¿HAN PENSADO VDS LO QUE HACEN CUANDO INHIBEN UN RECEPTOR ALFA Y BETA? Barth A et al. JACC 2006; 48:

27 EL RECEPTOR BETA ADRENÉRGICO

28 El Receptor adrenérgico de tipo Beta: “su vida”
Dzimirii et al. PharmRev 1999; 54 (3): 465

29 Dzimirii et al. PharmRev 1999; 54 (3): 465

30 Fig. 1. GPCR chimera and analysis of ligand binding domain. The GPCR
in the mythological rendition of a chimera (A). The three domains of a prototypic GPCR. The seven transmembrane segments (labeled in Roman numerals I–VII) of the GPCR constitute the lipid bilayer domain, displayed here as a lily pad. In the case of adrenergic receptors, this 7-TMS domain is the ligand-binding domain. The exofacial domain of GPCR includes the N-terminal region of the receptor (depicted as the lion head of the chimera) that is typically N-glycosylated with complex carbohydrate (CHO). For receptors that interact with peptide/protein ligands, the N-terminal exofacial region can be much larger and include motifs such as cysteine-rich domains (CRDs). The intracellular loops (labeled iLoop1, iLoop2, and iLoop3) and the C-terminal tail (-COOH) of a GPCR (depicted as the serpent head) constitute the cytoplasmic domains that are intimately involved in signal propagation to heterotrimeric G-proteins. In some GPCRs a cysteinyl residue in the C terminus beyond TMS VII is palmitoylated, creating a fourth loop (iLoop4). The intracellular loops are accessible to protein kinases, such as protein kinases A and C and G protein-coupled receptor kinase 2, and are subject to phosphorylation after activation by agonist. The phosphate groups are depicted as green spheres. Exofacial, transmembrane, and cytoplasmic domains of GPCR; swapping of exofacial domains dictates ligand binding/activation of LH/ FSH receptors (B). This schematic demonstrates that for the GPCRs that interact with glycoprotein ligands, the exofacial domain is large, complex, and dictates the ligand binding character of the chimera. The cytoplasmic domain dictates the downstream read-outs. The 7TMS domain of many GPCRs constitutes the ligand-binding domain for small molecular weight agonists/antagonists (C). For many small ligands (catecholamines, dopamine, adenosine, etc.) that bind GPCR, the ligand binding determinants are largely transmembrane in nature and the functional nature is dictated by the cytoplasmic domains (iloops 1–3 and C-terminal tail). It has been shown that after the receptor has been expressed and incorporated into the cell membrane, exhaustive proteolytic digestion can remove the exofacial loops, whereas the 7TMS remain intact, as does the ligand binding capacity for small molecule ligands (Morris and Malbon, 1999). Yin et al. MolPharm 2004; 65 (6): 1323

31 Representación 2D del Receptor Beta 1
Ralf Jockers et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 271,pp. 9355–9362

32 Representación 2D del Receptor Beta 2
A, helical net representation of the 2-adrenergic receptor. The highly conserved DRY motif is located at the cytoplasmic side of TM3. The conserved aspartic acid (Asp ) and the arginine (Arg ) are indicated with white letters in black circles. The conserved glutamic acid Glu at the bottom of TM6 is also indicated with a white letter in a black circle. The cysteine (Cys ) that becomes partially accessible in the D130N mutant and in a constitutively active mutant (13) is located in TM6 and is indicated with a black letter in a shaded circle. The highly conserved aspartic acid in TM2 (Asp ) is shown with a black letter in an enlarged white circle. The numbers in parentheses refer to the general numbering scheme for G-protein-coupled receptors proposed in Ref. 6. B, a sequence alignment of TM6 of multiple class A GPCRs is shown to indicate the partial conservation of Glu6.30. Ballesteros, J. A. et al. J. Biol. Chem. 2001;276:

33 Esquema 2D transmembrana Visión extracelular
Centro activo (“perfil”) Visión extracelular + Agonista Swaminath G et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 280, No. 23, 22165–22171

34 Vaidehi, Nagarajan et al. (2002)
Estructura 3D del Receptor Beta-1 (A) Predicted binding site of epinephrine in the predicted structure of 1-adrenergic receptor. (B) Residues within 5 Å of epinephrine bound to 1-adrenergic receptor. Shown in bold are the three residues Asp-138, Ser-229, and Ser-232 (deduced from mutation experiments to be involved in binding). Vaidehi, Nagarajan et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,

35 El centro activo 3D Vaidehi, Nagarajan et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,

36 Polimorfismos de a- Receptores
ADRA1A: (8p21) con 3 isoformas; se expresa en el corazón, cerebro, hígado y próstata, pero no está implicado en la insuficiencia cardiaca (IC). ADRA1B: (5q33) implicado en la aterosclerosis, contractilidad de la arteria aorta y en el control de la presión arterial sistólica. ADRA1D: (20p13) se considera un subtipo del 1A ADRA2A: (10q24-q26) se expresa fundamentalmente en las plaquetas. Cuando se estudian ratones con ausencia de este gen y del ADRA2C, se observa que desarrollan IC. ADRA2B: (cromosoma 2) no está implicado en la IC pero determinados polimorfismos se han relacionado con alteraciones del sistema nervioso autónomo y en el desarrollo de obesidad. ADRA2C: (4p16.1) la deleción de 4 pares de bases situada en los nucleótidos se ha asociado a un aumento del riesgo de 5,6 veces para desarrollar IC en la población de origen africano. Si junto a esta deleción se encuentra el polimorfismo Arg 389 (R389G) en el gen del receptor B1, el riesgo se multiplica por 10. OMIM

37 Polimorfismos de b- Receptores
ADRB1: (10q24-q26) se trata de un péptido de 477 aminoácidos que tiene una homología del 54% con el receptor B2. Se han descrito algunos polimorfismos con importancia en la IC como: R389G: Disminuye el riesgo de taquicardia ventricular (TV) (OR 0,3). Implicado en la obesidad y en la regulación de la termogénesis. Su presencia en homocigosis aumenta la fibrosis miocárdica y la existencia de IC. Así mismo es predictor de mejor respuesta a tratamiento con b-bloqueantes (carvedilol y/o bucindolol). S49G: su presencia condiciona una disminución de la frecuencia cardiaca media del %, con sus impicaciones. ADRB2: (5q32-q34) se trata de un péptido de 413 aminoácidos con algunos polimorfismos estudiados: R16G: aumenta el riesgo de padecer asma nocturno en 3,8 Q27E: relacionado con el riesgo de padecer obesidad. T164I: su presencia hace que disminuya la supervivencia por insuficiencia cardiaca. ADRB3: se trata de un péptido de 402 aác que parece estar implicado en la regulación de la termogénesis. OMIM

38 Polimorfismos de Receptores adrenérgicos
Small et al. N Engl J Med 2002;347:

39 Representación Molecular “3D” de la interacción TM3 /TM6 y diferentes mutaciones en el interior citoplasmático (nucleótido 6.300) Molecular three-dimensional representations of the interaction of TM3 and TM6 at their cytoplasmic ends and the effects of 6.30 mutations. The C traces are taken from the high-resolution structure of bovine rhodopsin (9). Except in A, the top of each panel shows the extracellular end, and the bottom of each panel shows the intracellular end of the TMs. A, an extracellular view of the high-resolution structure of rhodopsin showing the interaction between residues at the cytoplasmic ends of TM3 and TM6 (9). B, the C ribbons of TM3 and TM6 of rhodopsin are shown in pink. The simulated (see under "Materials and Methods") structures (blue ribbons) are superimposed from position 1 to 17 onto the corresponding parts of TM6 ( ). The blue arrow indicates the conformational space that a Pro kink can assume relative to TM3. C, a closer view of the interactions of Glu6.30-Arg3.50-Asp3.49 in a model of the 2AR based on the rhodopsin structure. In C, the wild type interactions are shown with the closest contacts between Glu6.30-Arg3.50 and Arg3.50 Asp3.49, which are within the distance range of an ionic interaction shown with dashed lines. D and E, the same view as C but with alterations in putative interactions after the mutation of Glu6.30 to Ala (D) or of Glu6.30 to Gln and of Asp3.49 to Asn (E). Ballesteros, J. A. et al. J. Biol. Chem. 2001;276:

40 Implicaciones clínicas de los Polimorfismos: métodos de estudio
Estudios en Humanos: Estudios de Asociación: establece la diferencia entre sujetos y controles en referencia a un marcador o rasgo. Estudios de Ligamiento: En árboles familiares se usan diferentes modelos de herencia para encontrar el más probable. En pares de hermanos: “concordancia entre gemelos”. 2. Estudios en animales de Experimentación

41 Implicaciones clínicas de los Polimorfismos: métodos de estudio
3. Estudios “In Vitro”: Se introducen Genes con diferentes mutaciones en células con alto coeficiente de replicación celular y se compara la expresión del Gen con su “wild type”. Células procedentes de mamíferos: CHO, COS, etc. Células procedentes del aparato reproductor femenino de determinados insectos: sf9, HELAS, etc. Se mide: Acumulación AMPc. Efecto de Agonistas/Antagonistas.

42 Protocolo de Mutagénesis Dirigida

43 Transfección del DNA mutado en células especiales
cDNA COS -7 Ag T

44 Estudios de expresión del nº de Receptores celulares
Shiina et al. JBC 2000; 275 (37):

45 Estudios de expresión de la respuesta al Agonista
Sugimoto et al. JPET 2002; 301(1): 51-9

46 Los “microarrays” Sauter, G. et al. N Engl J Med 2002;347:1995-1996
Edison T. et al. N Engl J Med 2004;350:

47 MICROARRAYS FUNCIONALES
Se comprueba mediante microarrays el valor de un fármaco para inhibir o expresar un gen en una determinada enfermedad Gullans SR. N Engl J Med 2006;November 9:

48 Estudios de la expresión de RNAm
As compared with the six betablocker– treated patients who did not have a response (mean change, a decrease of 2.5±1.8 EF units), those who did have a response had an increase in sarcoplasmic- reticulum calcium ATPase mRNA and a -myosin heavy chain mRNA and a decrease in b -myosin heavy chain mRNA. The change in sarcoplasmic-reticulum calcium ATPase was not present in the patients in the placebo group who had a spontaneous response. There were no differences between those who had a response and those who did not in terms of the change in mRNA or protein expression of -adrenergic receptors. Conclusions In idiopathic dilated cardiomyopathy, Lowes et al. NEJM 2002; 346 (18)

49 ..otros muchos mecanismos implicados…
Science; 5 Oct 2007: 510

50 CONCLUSIONES Rol Polimorfismos del Receptor adrenérgico debe ser precisado. La regulación postranslacional del Receptor es extremadamente compleja y a diferentes niveles. ¿Pueden explicar estos Polimorfismos la respuesta al tratamiento y la mortalidad por IC?

51 “Lo importante es no dejar de hacerse preguntas”
Albert Einstein

52 “He disfrutado mucho con esta obra de teatro, especialmente en el descanso”
Groucho Marx