ENSAMBLAMIENTO DE FRAGMENTOS DE ADN

Presentación del tema: "ENSAMBLAMIENTO DE FRAGMENTOS DE ADN"— Transcripción de la presentación:

1 ENSAMBLAMIENTO DE FRAGMENTOS DE ADN
Matías Brunstein Macri Alejandro Pedraza Jimena Rinaldi 2004 Introducción a la Biología Computacional Departamento de Computación-FCEN-UBA.

2 Biological Background
Primera Parte Biological Background

3 Genoma y Genómica Genoma. Complemento genético entero y haploide de un organismo. Es decir toda la secuencia de ADN, codificante o no codificante y su posición en los cromosomas. Genómica. Disciplina que se ocupa de la caracterización de los genomas. Se encuentra dividida en Genómica Estructural y la Genómica Funcional. Objetivo de la Genómica Estructural es conocer el/los genoma/s de una especie en particular/diferentes especies. .

4 Aplicaciones del estudio de los genomas
Predecir genes, secuencias promotoras y reguladoras de la transcripción. Comparar genomas de diferentes individuos de la misma especie para detectar variaciones o polimorfismos a nivel poblacional. Estas variaciones pueden ser sustituciones, deleciones/inserciones, o rearreglos cromosómicos (cambio de posición en el genoma).

5 Aplicaciones del estudio de los genomas
Comparar genomas de diferentes especies. Esto permite hacer inferencias acerca de los procesos evolutivos de remodelación de genomas. Otras.

6 Genomas eucarióticos y procarióticos

7 Genomas animales y vegetales

8 Sizes of eukaryotic genomes
Species Genome size (Mb) Fungi Saccharomyces cerevisiae 12.1 Aspergillus nidulans 25.4 Protozoa Tetrahymena pyriformis 190 Invertebrates Caenorhabditis elegans 97 Drosophila melanogaster 180 Bombyx mori (silkworm) 490 Strongylocentrotus purpuratus (sea urchin) 845 Locusta migratoria (locust) 5000 Vertebrates 400 Takifugu rubripes (pufferfish) Homo sapiens 3200 Mus musculus (mouse) 3300 Plants Arabidopsis thaliana (vetch) 125 Oryza sativa (rice) 430 Zea mays (maize) 2500 Pisum sativum (pea) 4800 Triticum aestivum (wheat) 16000 Fritillaria assyriaca (fritillary) 120000

9 Paradoja del valor C

10 Secuencias repetitivas
Distintos tipos de secuencias repetitivas se encuentran en muchos organismos y ocupan gran parte de los genomas: Satélites Pseudogenes Transposones y retrotransposones Pueden estar esparcidas por el genoma o en tandem y varían mucho en tamaño.

11 ¿Cómo se estudian los genomas?
Mapeo genético Mapeo físico Secuenciación exhaustiva

12 El mapeo genético El mapeo genético está basado en la utilización de técnicas genéticas para construir mapas que muestran la posición de marcadores genéticos o de marcadores moleculares. Las técnicas genéticas incluyen experimentos de recombinación y estudio de pedigrees en humanos.

13 El mapeo físico El mapeo físico utiliza técnicas de Biología Molecular para examinar directamente las moléculas de ADN para la construcción de mapas que muestran la posición de fragmentos de ADN (en general de secuencia desconocida) en el genoma.

14 Secuenciación automática
Fragmentos de hasta 700 pb

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16 Bibliotecas genómicas
Como no es posible secuenciar un genoma en una sola reacción de secuenciación se lo divide en fragmentos, los cuales se almacenan en clones bibliotecas genómicas. Una biblioteca genómica es un conjunto de clones, cada uno de los cuales contiene un fragmento de un genoma de un organismo dado. Las bibliotecas genómicas se consiguen clonando los fragmentos en vectores.

17 Clonado de fragmentos

18 Vectores de clonado utilizados para secuenciación de genomas
Fago λ YAC Cósmido

19 Vectores de Clonado Problema de los YACs

20 Vectores de Clonado Otros vectores que incluyen insertos de gran tamaño: Bacteriógafos P1 BACs PACs Fósmidos

21 Sizes of human genomic libraries prepared in different types of cloning vector
Type of vector Insert size (kb) Number of clones* P = 95% P = 99% l replacement 18 Cosmid, fosmid 40 P1 125 77 000 BAC, PAC 300 32 000 50 000 YAC 600 16 000 24 500 Mega-YAC 1400 6850 10 500 * Calculated from the equation:where N is the number of clones required, P is the probability that any given segment of the genome is present in the library, a is the average size of the DNA fragments inserted into the vector, and b is the size of the genome.

22 Ensamblado: Shotgun approach
Consiste en ensamblar directamente los fragmentos de ADN secuenciados por superposición.

23 Haemophilus influenzae 1995
1830 kb, biblioteca genómica clones, insertos de 1,6-2 kb.

24 Resolución de gaps

25 Los contigs se pueden construir por chromosome walking

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27 Ensamblado: Clone Contig Approach
Se clonan fragmentos de hasta 1,5 Mb en YACs o BACs. Se construye un contig identificando los clones que contienen fragmentos superpuestos, los cuales se secuencian por el método de shotgun.

28 Whole genome shotgun sequencing
La experiencia con el método de shotgun en genomas chicos mostró que si el largo total de la secuencia que se genera es 6,5-8 veces el largo de la secuencia total del genoma estudiado, entonces los contigs resultantes ocuparan el 99,8% de la secuencia del genoma, con unos gaps tales que se pueden resolver facilmente. 70 millones de fragmentos de 500pb resolverían el genoma humano en 3 anos con 75 secuenciadores, cada uno de los cuales puede secuenciar 1000 secuencias de esas por días.

29 Ejemplo de genomas de los cuales se ha publicado la secuencia en versión completa o borrador
Especie Tamaño del genoma (Mb) Nro de genes estimados Eukarya Arabidopsis thaliana (plant) 125 25 500 Caenorhabditis elegans (nematode) 97 19 000 Drosophila melanogaster (fruit fly) 180 13 600 Homo sapiens (human) 3200 Saccharomyces cerevisiae (yeast) 12.1 5800 Eubacteria Escherichia coli K12 4.64 4400 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 4.41 4000 Mycoplasma genitalium 0.58 500 Pseudomonas aeruginosa PA01 6.26 5700 Streptococcus pneumoniae 2.16 2300 Vibrio cholerae El Tor N16961 4.03 Yersinia pestis CO92 4.65 4100 Archeae Archaeoglobus fulgidus 2.18 2500 Methanococcus jannaschii 1.66 1750

30 Complicaciones Instancias reales del problema muy largas Errores
Inserciones Deleciones sustituciones Fragmentos quiméricos Orientación desconocida Regiones repetidas Pérdida de cobertura (gaps)

31 Segunda Parte Modelos

32 ¿Qué es un modelo? Es una abstracción de la realidad que nos facilita el estudio de un fenómeno o problema. Un modelo no es un algoritmo Como veremos más adelante, para un mismo modelo pueden plantearse varios algoritmos.

33 Modelos para el ensamblamiento de ADN
Plantearemos tres modelos teóricos. Shortest Common Superstring Reconstruction Multicontig Cada uno plantea distintas restricción sobre los fragmentos. Se asume que las muestras están libres de contaminación.

34 Primer Modelo: Shortest Common Superstring
Tiene principalmente interés teórico pues no es muy útil en la realidad. Plantea muchas restricciones: Los fragmentos no deben tener errores Deben estar orientados correctamente La secuencia buscada no debe tener repeticiones

35 SCS: Definición Dado un conjunto de strings F, hallar un string S de longitud mínima tal que para todo string f en F, f es substring de S. Notar que S debe ser un superstring perfecto, por lo que no permites errores experimentales. Se debe conocer la orientacíon de cada string f.

36 SCS: Ejemplo F = {ACT, CTA, AGT} S = ACTAGT A C T G S =

37 SCS: Repeticiones Supongamos que secuenciamos la siguiente cadena de nucleótidos S = ACTTGTAAGGTTGTTAAG de la cual obtenemos los siguientes fragmentos F = {ACTT, TTGTAA, AAGGT, TTGT, GTT, TTAG}

38 SCS: Repeticiones (Cont.)
Según este modelo, el resultado de hallar el SCS de F sería: A C T G S’ =

39 SCS: Resumen No admite repeticiones No admite errores experimentales
Se debe conocer la orientación de los fragmentos. Es un problema NP-Hard. No resulta práctico para aplicaciones reales debido a la gran cantidad de restricciones y limitaciones.

40 ¿Qué significa NP-Hard?
NP-Completo se refiere a una familia de problemas de decisión para los cuales no se conoce una solución polinomial. Los problemas de decisión son aquellos para los que se espera una respuesta del tipo “sí” o “no”.

41 ¿Qué significa NP-Hard?
En el caso del TSP, el problema sería: ¿Existe un camino que pase por todas las ciudades exactamente una vez recorriendo una distancia menor a 500 Km.? La respuesta esperada es simplemente “sí” o “no”.

42 ¿Qué significa NP-Hard?
Un problema HP-Hard es el problema de optimización asociado a un problema NP-Completo. En nuestro caso: ¿Cuál es el camino más corto que pasa exactamente una vez por cada ciudad?

43 Segundo Modelo: Reconstruction
Este modelo tiene en cuenta: Errores. Orientación desconocida Pero no modela: Repeticiones Falta de cubrimiento

44 Reconstruction: Definiciones
Para entender como este modelo considera los errores debemos contar con algunas definiciones previas. Distancia de edición (o edit distance) Distancia de edición de substrings (o substring edit distance) Substring aproximado

45 Distancia de Edición Dadas dos cadenas a y b, llamaremos distancia de edición, y lo notaremos d(a, b), a la cantidad de inserciones, deleciones y/o substituciones que deben realizarse sobre las cadenas para que valga a = b. Ejemplo: d(ACTGT, AGGT) = 2 pues ACTGT = ACTGT Substitución Inserción

46 Distancia de Edición de Substrings
Dadas dos cadenas a y b, llamaremos distancia de edición de substrings a: donde S(b) es el conjunto de los substrings de b. Ejemplo: ds(ACT, GATTACA) = 1 Pues d(ACT, ACA) = 1 y ACT  S(b)

47 Substring Aproximado Sea  un número real entre 0 y 1. Un string f es un substring aproximado de S con error  cuando donde |f| es la longitud del string f. Por ejemplo: si  = 0.05, permitiremos que f difiera en a lo sumo un 5% con el substring màs cercano en S.

48 Reconstruction: Definición
Dado un conjunto de strings F y una cota de error  entre 0 y 1, hallar un string S de longitud mínima tal que para todo string f en F donde f es el string reverso y complementario a f.

49 Reconstruction: Resumen
No admite repeticiones ni espacios no cubiertos Admite errores experimentales Modela la orientación desconocida Es un problema NP-Hard. SCS es un caso particular de este modelo.

50 Tercer Modelo: Multicontig:
Introduce la noción de buen enlace. Este modelo tiene en cuenta: Errores. Orientación reconocida Falta de cubrimiento En algunos casos, repeticiones

51 Multicontig: Definiciones
Llamaremos layout a un alineamiento múltiple de un conjunto de secuencias. El siguiente layout será utilizado como ejemplo en varias definiciones: f1: C T G A f2: f3: f4: f5:

52 Multicontig: Definiciones (cont.)
Diremos que dos fragmentos f y g se solapan (y lo llamaremos overlap) si comparten una o más columnas en el layout. Es decir, si ambos string se intersecan. f1: C T G A f2: f3: f4: f5:

53 Multicontig: Definiciones (cont.)
Podemos separar los overlaps en dos categorías: Los que producen un enlace. (f3 – f4) y los que no lo producen. (f2 – f5) f1: C T G A f2: f3: f4: f5:

54 Multicontig: Definiciones (cont.)
El enlace más débil (weakest link) es aquél overlap con menor longitud que produce un enlace. Diremos que un layout es un t-contig si el enlace más débil que posee tiene longitud t. Si es posible obtener un t-contig de un conjunto de fragmentos F, diremos que F admite un t-contig.

55 Multicontig: Definición I Libre de Errores
Dado un conjunto de strings F y un entero t, particionar F en el mínimo número de subconjuntos Ci, 1 ≤ i ≤ k, tal que cada Ci admita un t-contig.

56 Multicontig: Ejemplos
Dado F = {GTAC, TAAG, TGTAA} Si t = 3 T A G C Si t = 2 Si t = 1

57 Multicontig: Contemplando errores
Si se admiten errores en el acoplamiento, se debe obtener una cadena por consenso que será el resultado del ensamblamiento. Diremos que S es una cadena -consensuada de F si, para cada cadena f en F, la distancia de edición entre f y su imagen en S es ≤ | f |.

58 Multicontig: Contemplando errores
Por ejemplo: S es una cadena 0.20 – consensuada con respecto a F. f1: C T A f2: G f5: S

59 Multicontig: Definición II Admitiendo de Errores
Dado un conjunto de strings F, un entero t ≥ 0 y una tolerancia de error  entre 0 y 1, particionar F en el mínimo número de subconjuntos Ci, 1 ≤ i ≤ k, tal que cada Ci admita un t-contig con un consenso .

60 Multicoting: Resumen Admite repeticiones en algunos casos.
Admite errores experimentales Modela la orientación desconocida Es un problema NP-Hard.

61 Tercera Parte Algoritmos

62 Repaso de Grafos Los grafos son artefactos matemáticos que permiten expresar de una forma visualmente sencilla y efectiva las relaciones que se dan entre elementos de muy diversa índole.

63 Repaso de Grafos Un grafo simple está formado por dos conjuntos:
Un conjunto V de puntos llamados vértices o nodos. Un conjunto E de pares de vértices que se llaman aristas o arcos y que indican qué nodos están relacionados. Notación: G(V,E) x x y

64 Repaso de Grafos A los ejes se les puede asignar un peso. Notación: w(x,y) Si hay más de un arco hablamos de un multigrafo Si los arcos se recorren en una en una dirección concreta pero no en la contraria lo llamamos grafo dirigido o dígrafo y los arcos son aristas 8 x y x y x y x y

65 Repaso de Grafos v1 v1 Un Camino es una secuencia de vértices V1, V2, V3, ... , Vn, tal que cada para uno de estos V1->V2, V2->V3, V1->V3 Un Camino Simple es cuando todos sus vértices, excepto tal vez el primero y el último son distintos. Un Ciclo Simple es un camino simple de longitud por lo menos de uno que empieza y termina en el mismo vértice. Se dice que un grafo es aciclíco cuando no contiene ciclos. v2 v2 v3 v3 v4 v4 v1 v1 v2 v2 v3 v3

66 Representado el problema como un grafo
Se representa con un grafo ya que resulta mas amigable para verlo visualmente, y se le esta aportando al problema, todo un conjunto de herramientas matemáticas para resolverlo.

67 Representado el problema como un grafo
Datos del problema: Un conjunto de fragmentos F F = {ACTT, TTGTAA, AAGGT, TTGT, GTT, TTAG} Un string S S = ACTTGTAAGGTTGTTAAG El overlap de los fragmentos ACTT TTGTAA

68 Representado el problema como un grafo
Datos del problema: El orden en que se hace el overlap ACTT TTGTAA TTGTAA ACTT La cantidad de nucleotidos que están en el overlap ACTT TTGTAA nucleótidos

69 Representado el problema como un grafo
Fragmentos son representados por los nodos o vértices. Los overlap’s son representados por los ejes que unen a los nodos. El orden del overlap de dos fragmentos, esta dado por la dirección del eje o arista. La cantidad de nucleótidos que estan en el overlap de dos fragmentos, esta representado por el peso de los ejes. El string s se representa como un camino en el grafo.

70 Representado el problema como un grafo
Ejemplo: F={TACGA, ACCC, CTAAAG, GACA} a b c d 1 a b 2 1 1 c 1 d

71 Representado el problema como un grafo
Ejemplo: F={TACGA, ACCC, CTAAAG, GACA} a b c d 1 a b 2 1 1 c 1 d

72 Representado el problema como un grafo
Ejemplo: F={TACGA, ACCC, CTAAAG, GACA} a b c d S1= TACGACCCCTAAAGACA S2= TACGACACCCTAAAG 1 1 a b a b 2 2 1 1 1 1 c 1 c d 1 d

73 Representado el problema como un grafo
Problema: Encontrar el superstring mas corto. Esto es equivalente a encontrar un camino hamiltoniano máximo dentro del grafo. Este problema es NP-Completo

74 Algoritmos Greedy Aplica al modelo SCS y Reconstruction
Subgrafo Acíclico Aplica al modelo Multiconting

75 Algoritmo Greedy En cada paso intenta maximizar la solución del subproblema analizad. No retrocede una vez tomada cada decisión.

76 Algoritmo Greedy Construimos un grafo dirigido a partir del multigrafo formado por los fragmentos de F, dejando entre cada par de nodos únicamente las aristas mas pesadas, ya que estamos buscando el camino mas pesado

77 Algoritmo Greedy Entrada: Grafo orientado con n vértices.
Salida: Camino hamiltoniano en el grafo de entrada //Inicio Para i<-1 hasta n in[i] <-0 //cuantos ejes entran en i out[i] <-0 // cuantos ejes salen de i MakeSet(i) //Proceso Ordenar los ejes de acuerdo a a su peso, con el mas pesado primero Para cada eje (f,g) en ese orden Si in[g] = 0 y out[f] = 0 y FindSet(f) =/= FindSet(g) seleccionamos el eje (f,g) in[g] <- 1 out[f] <- 1 Union(FindSet(f), FindSet(g)) Si queda una sola componente terminar Retornar los ejes seleccionados

78 Algoritmo Greedy La solución encontrada es a lo sumo 2,75 veces peor que la optima, y se conjetura que lo es 2 veces. Este algoritmo, no siempre encuentra una solución. 2 2 3 ATGC GCC TGCAT

79 Algoritmo Subgrafo Acíclico
Este algoritmo restringe la hipótesis, asumiendo que los fragmentos están libres de errores, que se conoce la orientación y que fueron obtenidos de un buen secuenciamiento. Se entiende por buen secuenciamiento, básicamente, a que los fragmentos cubren a la molécula en su totalidad y que se garantiza el overlap.

80 Algoritmo Subgrafo Acíclico
Dado un multigrafo con los fragmentos en los nodos, obtenemos un grafo dirigido, quedándonos con las aristas de mayor peso entre los nodos, ya que queremos encontrar el camino mas pesado. Luego quitamos todas las aristas que tengan un peso menor al t-contig deseado. De forma tal que quede un subgrafo acíclico Luego se busca un camino hamiltoniano máximo en el subgrafo acíclico. Esto es polinomial y se puede resolver con un algoritmo greedy.

81 Algoritmo Subgrafo Acíclico
Ejemplo: Consideremos que queremos llegar al string S y tenemos los fragmentos w, z, u, x e y S = AGTATTGGCAATCGATGCAAACCTTTTGGCAATCACT w = AGTATTGGCAATC z = AATCGATG u = ATGCAAACCT x = CCTTTTGG y = TTGGCAATCACT Y se pide un t-contig de 3

82 Algoritmo Subgrafo Aciclico
El subgrafo acíclico de de los overlap’s quedaría de la siguiente forma: 9 4 3 3 4

83 Heurística Buscar overlap Ordenar los fragmentos
Para cada par de fragmentos, calcular el match prefijo-sufijo. Usar el algoritmo de programación dinámica de alineamiento semiglobal sin penalidad. Ordenar los fragmentos Construir el camino con un algoritmo greedy o heurística Cada camino tiene su correspondiente camino complementario No es necesario incluir fragmentos incluidos en otros Los ciclo y cubrimientos abundantes pueden indicar repeticiones. Alineamiento y consenso

84 Bibliografía Brown, T. A., Genomes, 2002, 2nd. Edition, BIOS Scienfic Publishers, Ltd. Griffiths A., Miller J., Suzuki D. & Lewontin R, An Introduction to Genetic Analysis, 2000, 7th ed. Freeman & Company Meidanes Prevner Baxevanis