Aislamiento de Plásmidos

Presentación del tema: "Aislamiento de Plásmidos"— Transcripción de la presentación:

1 Aislamiento de Plásmidos
Bioquímica Experimental Equipo 3 Cabrera Peralta Andrea Fuentes Pineda Rosinda Gómez Reynoso Claudia Nathalli Ortiz Pastrana Naytzé

2 ¿Que es un plásmido? Los plásmidos son moléculas de ADN que se encuentran en las bacterias, y que son independientes del cromosoma bacteriano. No son vitales para la célula

3 Sus principales características son:
Son pequeños (unos cuantos miles de pares de bases) Suelen llevar sólo uno o unos pocos genes Son circulares Tienen un único origen de replicación Múltiple número de copias Marcadores Seleccionables

4 Al igual que el DNA cromosomal el plásmidico puede presentar las siguientes características:
Doble hélice Estabilizada por puentes de hidrógeno En la célula generalmente superempacada o superenrollada

5 Conformaciones de un plásmido
Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado Esto va ha ser importante cuando cortemos el plásmido y lo veamos en un gel de Agarosa

6 TOPOISOMEROS. Producto del superenrollamiento plásmido
Existen varias conformaciones de los plásmidos en el estado superenrollado. Por lo que pueden migrar en un campo eléctrico de manera muy diferente cada uno a pesar de tener el mismo peso molecular Mismo peso diferentes conformaciones, entre más burbujas y enrollamientos tenga, más difícil se le hará pasar a través de la malla de la agarosa

7 Los plásmidos han sido modificados en el laboratorio para su uso como herramientas de ingeniería genética, ya que son útiles en la expresión de genes particulares

8 Estructura plásmido usado en biología molecular. Vector de clonación
Se compone básicamente de: Origen de replicación Genes de resistencia a antibióticos (Marcador de selección) Sitio múltiple de clonación

9 Realizar el aislamiento de DNA plasmídico.
Objetivos Realizar el aislamiento de DNA plasmídico. Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación de DNA genómico.

10 Reactivos 5mL de medio Luria-Kanamicina (30μg/mL)
Solución GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris/HCl pH=8.0 y EDTA 10mM pH=8.0 Solución de lisis: 0.2N NaOH y 1% SDS p/v 3M Acetato de potasio pH=4.8 70% Etanol Isopropanol

11 Fundamento: Obtención de plásmido mediante la técnica de LISIS ALCALINA
- Desnaturalización alcalina en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) - Se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalización y renaturalización del ADN de plásmido versus el ADN cromosomal

12 DNA se puede desnaturalizar
El calor, pH, la concentración de iones, influyen en la estabilidad de la doble hélice. En la desnaturalización se deshace su estructura nativa, es decir se eliminan sus puentes de hidrógeno. Dos hebras separadas que se pueden volver a unir.

13 La re-naturalización El DNA se puede volver a re-naturalizar.
Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto. De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.

14 Proceso de desnaturalización y renaturalización

15 Paso 1 - Crear un ambiente osmótico hostil para la bacteria para
lograr su lisis y liberar el material genético - Comenzar por desestabilizar a la membrana bacteriana Solución GTE de alta concentración de sales, glucosa y ácido etilendiamino tetracético (EDTA)

16 Paso 2 - Solución con una alta concentración de SDS e hidróxido
de sodio. SDS: Lisar la membrana celular. NaOH: Desnaturalizar el ADN. El ADN cromosomal se desnaturaliza más rápidamente que el ADN de plásmido (cerrado).

17 Paso 3 A la mezcla de ADN desnaturalizado tanto plásmido como cromosomal se le añade acetato de potasio para regresar a un pH menos drástico y que se vuelvan a formar los puentes de hidrógeno. Sin embargo, el ADN cromosomal es muy largo y por tanto no logra establecer bien sus puentes de hidrógeno y forma un agregado junto con el SDS y las proteínas bacterianas, el cual precipita. Al centrifugar, en el sobrenadante queda el ADN plasmídico y en el botón el cromosomal

18 Paso 4 El ADN del plásmido del sobrenadante se transfiere a otro tubo y es concentrado por precipitación con etanol en frío. Centrifugar y tirar el sobrenadante El botón de DNA plasmídico se puede lavar nuevamente con etanol o isopropanol. Resuspender el botón en agua y almacenar

19 Atención! Es posible que la muestra contenga trazas de DNAasas bacterianas Para evitar la degradación de las moléculas de ADN por estas enzimas, se aconseja trabajar de forma rápida y con soluciones a baja temperatura

20 Bibliografía C. J. Puerta, C. P. Ureña. (2001). Prácticas de Biología Molecular. Pontificia Universidad Javeriana. p J. B. Jenkins. (1985). Genética. Reverté. Barcelona. p