16. Estudio pormenorizado de

Presentación del tema: "16. Estudio pormenorizado de"— Transcripción de la presentación:

1 16. Estudio pormenorizado de
algunas proteínas

2 Hemoglobina y Mioglobina
Hemoproteínas: Hemoglobina y Mioglobina

3 Hemoproteínas Son proteínas conjugadas cuyo grupo prostético es una porfirina coordinada a un ion metálico. Suelen estar relacionadas con todos los aspectos del metabolismo aeróbico - Transportadores de oxígeno como la hemoglobina y la mioglobina - Clorofilas: porfirinas coordinadas a un ion Mg++ - Transportadores electrónicos como los citocromos - Enzimas relacionadas con el transporte electrónico como la citocromo oxidasa - Enzimas relacionadas con el stress oxidativo, como las peroxidasas - Coenzimas cobamídicas o corrinoides (vit. B12)

4 Hemo a: citocromo oxidasa

5 Hemo c: citocromo c

6 Citocromo c

7 Met 80 Fe Cys 14 Cys 17 Hemo c His 18 Entorno del grupo hemo en el citocromo c

8 R: Mg++ Clorofilas

9 Bacterioclorofila

10 Transporte en sangre de O2
1 L de sangre arterial desprende 200 mL de O2 STP. Dada su poca solubilidad, es de suponer que la mayoría circula en forma de alguna combinación química. En efecto, el oxígeno circula en combinación con la hemoglobina, presente a la concentración de 145 g/L en sangre, toda ella en el interior del hematíe (eritrocito, góbulo rojo), a su vez en cantidad de unos 5 x 106 por ml. El peso molecular de la hemoglobina es de (2.2 mmoles.L-1); los 200 mL de O2 suponen 8.8 mmoles.L-1; por tanto, el transporte se hace en razón de 8.8/2.2 = 4 moles de oxígeno por mol de hemo- globina.

11 Teniendo en cuenta que en la molécula de hemoglobina hay cuatro
átomos de hierro, podemos decir que el transporte tiene lugar en una proporción de un mol de oxígeno por mol de hierro. La sangre arterial está equilibrada con una presión parcial de oxígeno de aproximadamente mm Hg. La sangre venosa está equilibrada con una presión parcial de oxígeno de aproximadamente 40 mm Hg. La sangre arterial está saturada prácticamente a 100 %; la venosa, un 70 %. Por tanto, el paso por los tejidos periféricos desprende un 30 % del oxígeno combinado con la hemoglobina.

12 Hemoglobina: proteína globular, conjugada y oligomérica
- Grupo prostético: hemo hemo: protoporfirina IX + ion ferroso Fe2+ - Cuatro subunidades, iguales dos a dos: Hemoglobina A1 (HbA1): a2b2 Hemoglobina A2 (HbA2): a2d2 Hemoglobina fetal (HbF): a2g2 Hemoglobina Gower 1: z2e2 Hemoglobina Gower 2: a2e2 Hemoglobina Portland: z2g2 - Se conoce, además, un gran número de hemoglobinas mutantes.

13 Grupo Hemo b: Protoporfirina IX + Fe

14 Hélice F Entorno del grupo hemo en la mioglobina Fe++ His 93 Hélice E

15 Tanto en la hemoglobina como en la mioglobina,
el hierro siempre está en estado ferroso, Fe ++ Cuando el ion ferroso, Fe++ se oxida a férrico, Fe +++, la hemoglobina se convierte en metahemoglobina, que no es funcional Conviene no confundir metahemoglobina con oxihemoglobina, que es la forma oxigenada (pero no oxidada) de la hemoglobina Desoxihemoglobina + 4O2 Oxihemoglobina

16 Homología de secuencia a - b - Mioglobina
Cadena a V-LSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHF-DLSH-----GSA 53 Cadena b VHLTPEEKSAVTALWGKV--NVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNP 58 Mioglobina -GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59 *: : * **** * *.* *:: .* * * * .* Cadena a QVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL 113 Cadena b KVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHF 118 Mioglobina DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKH 119 .:* ** .* *: . : : : .*:: *. * :: :.::.. :: .* : Cadena a PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR Cadena b GKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH Mioglobina PGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG 153 :* . .:.: :* : . . :: :*:

17 Hélice C C Hélice D Hélice F Hélice E Hélice B Hél ce H lice G N Hélice A

18 Subunidad b Subunidad a Mioglobina

19 Situación del grupo hemo

20 a1 b1 b2 Hemoglobina A1 (forma T, desoxi-) a2

21 a1 b2 b1 Hemoglobina A1 (forma R, oxi-) a2

22 Hélice F Entorno del grupo hemo en la desoxihemoglobina His 87 (a) His 92 (b) Hélice E

23 Entorno del grupo hemo en la oxihemoglobina O2 Hélice F His 87 (a) His 92 (b) Hélice E

24 Saturación de O2 en Mioglobina y Hemoglobina

25 Vol., Mb Vol., Hb

26 Concepto de P50 P50 Mb P50 Hb

27 (Efecto Bohr) pH 7.0 pH 7.4 pH 6.6

28 60 mmHg 40 mmHg 80 mmHg

29 0.1 mM 1 mM

30 Modelo MWC Forma R, oxi- s s s s s s s s s s L i i i i i i i i i i Forma T, desoxi-

31 Contacto a-a, desoxihemoglobina

32 Contacto a-a a2 a2 a1 a1 Oxi- Desoxi- Arg 141 (C-t) Asp 126
Lys 127 Lys 127 a1 Oxi- Desoxi-

33 Contacto a-b, desoxihemoglobina

34 b b b a a Contacto a-b His 146 (C-t) His 146 (C-t) Lys 40 Lys 40
Glu 43 a Glu 43 a Arg 92 Arg 92 Desoxi- Oxi-

35 Contacto a-b b b a a Asp 99 Asp 99 Tyr 42 Tyr 42 Forma T, desoxi-
Forma R, oxi-

36 Contacto b-b, desoxihemoglobina

37 Contacto b-b His 2 His 2 His 143 Val 1 Val 1 His 143 Lys 82 Lys 82
2,3-BPG His 2 Forma T, desoxi- Forma R, oxi-

38 Forma T, desoxiHb Movimiento del ion Fe++ en la oxigenación de la hemoglobina Forma R, oxiHb

39 Inmunoglobulinas

40 Todos los organismos vivientes tienen mecanismos
para distinguir lo propio de lo extraño - Hongos y plantas, por ejemplo, mediante la producción de metabolitos secundarios potencialmente tóxicos para otros organismos: antibióticos, alcaloides, etc. - Bacterias, mediante el sistema de restricción de DNA: DNAs extraños son degradados específicamente por las enzimas de restricción - Vertebrados, mediante el sistema inmune.

41 El sistema inmune consta de dos tipos de respuesta:
- La inmunidad celular, mediante la cual células inmunocompe- tentes ( linfocitos T) eliminan células extrañas introducidas en el organismo (p.e. un injerto, un tumor, una célula transforma- da por un virus, etc.) - La inmunidad humoral, en la que otras células inmunocom- petentes (linfocitos B) producen proteínas específicas dirigidas contra lo extraño, llamadas anticuerpos. - Todos los anticuerpos pertenecen a una superfamilia de proteínas conocidas como inmunoglobulinas

42 Llamamos antígeno a la molécula que, introducida en un orga-
nismo, produce una respuesta inmune, sea humoral o celular. En la inmunidad humoral, el antígeno se une específicamente a un linfocito B que produce un anticuerpo complementario. Este linfocito se multiplica (clon celular) y se transforma en célula plasmática o plasmocito, que es la célula encargada de la producción de anticuerpos. Cada linfocito B produce un solo y único tipo de anticuerpo. Por esa razón, los anticuerpos obtenidos de un único clon de linfocitos B reciben el nombre de anticuerpos monoclonales.

43 El estudio de las inmunoglobulinas se vio facilitado por la
naturaleza de los mielomas, tumores malignos de células plasmáticas, que producen un solo tipo de anticuerpo (anti- cuerpo monoclonal). En algunos mielomas humanos se produce la llamada proteína de Bence-Jones, que es excretada en la orina, a partir de la que se puede purificar. Es fácil inducir mielomas en ratón. A partir de todas estas circunstancias se pueden obtener anti- cuerpos químicamente puros (monoclonales) lo cual facilita el estudio químico de las inmunoglobulinas

44 Porter, 1959: El tratamiento con papaína escinde la molécula de inmunoglobulina (Ig) en tres fragmentos, dos de ellos idénticos: dos Fab y un Fc Fab: Antigen Binding (fijador de antígeno) Fc: Crystallizable (cristalizable) Edelman, 1959: El tratamiento con mercaptoetanol y guanidina 8M, seguido de cromatografía, disocia la Ig en dos componentes de pesos moleculares 50 kDa (H, de heavy, pesado) y 25 kDa (L, de light, ligero). Como el peso molecular de la Ig nativa es de 150 kDa, se deduce que su estructura es H2L2

45 Por estudios inmunológicos, se detectan los siguientes isotipos:
- Cadena ligera: k, l - Cadena pesada: g, a, m, d, e En los dominios constantes puede haber una ligera variabilidad en cada cadena (afecta a uno o dos aminoácidos) dando lugar a las variantes conocidas como alotipos En los dominios variables hay muy poca homología de secuencia; cada anticuerpo es único hacia su antígeno: los idiotipos En cualquier caso, en cada anticuerpo las dos cadenas ligeras y las dos pesadas son iguales entre sí.

46 L H H L Inmunoglobulinas Cadena pesada o H: g, a, m, d, e
Cadena ligera o L: k, l L N VL N CL VH C CH1 H C CH3 CH2 H C CH3 CH2 CH1 C CL VH Puente disulfuro N VL Inmunoglobulinas N L

47 Cadenas ligeras 212 aminoácidos 2 dominios: VL, N-t (108aa) CL, C-t (104 aa) Cadenas pesadas Variable; 450 aminoácidos en IgG Cuatro o cinco dominios: VH, N-t (108 aa) CH1, CH2, CH3 (y CH4) En los dominios constantes hay posibilidad de variaciones alotípicas (uno o dos aminoácidos solamente)

48 L H Regiones hipervariables (CDR) en el dominio
variable de las cadenas H y L en las Ig L N C 1 30 50 93 H N C 35 60 87 105

49 Dominio de Inmunoglobulina

50 Cadena ligera, L C N CL VL

51 VH Cadena pesada, H N C CH1 CH3 Oligosacárido CH2

52 L Cys H128 Cys L 214 (C-t) H Puente disulfuro entre cadenas pesada y ligera

53 Fab Inmunoglobulina G H1 H2 Oligosacárido L1 Fab L2 Fc

54 g2k2 , g2l2 Inmunoglobulina G
- Constituye el % de las Ig séricas - Contingente mayoritario de la respuesta inmune secundaria - Cuatro tipos distintos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 - Monomérica - Bajo contenido en carbohidrato (2-3 %)

55 (a2k2)2 , (a2l2)2 Inmunoglobulina A
- Constituye el % de las Ig séricas - Es la Ig propia de las secreciones (jugo gástrico, saliva, leche) - Dos tipos: IgA1, IgA2 - Normalmente dimérica: unión covalente por el péptido J - Alto contenido en carbohidrato (7-12 %)

56 (m2k2)5 , (m2l2)5 Inmunoglobulina M
- Constituye el 5-10 % de las Ig séricas - Es la respuesta inmune primaria - Cinco dominios en la cadena pesada - Elevada proporción de carbohidrato (12 %) - Pentámero unido por disulfuros y un péptido J

57 d2k2 , d2l2 Inmunoglobulina D - Muy baja concentración en suero (1 %)
- Posiblemente relacionada con el receptor de antígeno - Alto contenido en carbohidrato (9-14 %)

58 e2k2 , e2l2 Inmunoglobulina E - La más minoritaria
- Cinco dominios en la cadena H - Membrana de mastocitos y basófilos - Relacionada con inmunidad a parásitos helmínticos - Relacionada con fenómenos de hipersensibilidad (alergia) inmediata: fiebre del heno, asma. - Alto contenido en carbohidrato

59 Colágeno

60 Proteína fibrosa, constituída por empaquetamiento de
moléculas de tropocolágeno o monómero de colágeno Tropocolágeno: tres helicoides entrecruzados, cada uno de peso molecular en torno a los 300 kDa, alrededor de 1000 aminoácidos, con una gran cantidad de residuos de Gly, así como de Pro, normal o hidroxilada. Los residuos de Lys pueden aparecer asimismo modificados, bien como 5-hidroxilisina, o como lisina aldehídica (Al-lisina). Es muy abundante en todos los tejidos de origen mesodérmico, particularmente en tendones, dermis, fascias y hueso.

61 Disposición de los monómeros de colágeno en la microfibrilla,
Tropocolágeno Disposición de los monómeros de colágeno en la microfibrilla, que da lugar a un patrón estriado al microscopio electrónico

62 Las cadenas de tropocolágeno aparecen unidas unas a otras
en la microfibrilla mediante: - Cadena lateral de al-lisina unida a cadena lateral de lisina no modificada a través de base de Schiff y posterior reducción - Cadena lateral de al-lisina unida a otra al-lisina a través de condensación aldólica - Enlaces de hidrógeno entre el grupo -C=O de la prolina y el -N-H de la glicina, siempre intercatenarios

63 Señal Propéptido N-terminal Helicoide Propéptido C-terminal
MFSFVDLRLLLLLAATALLTHGQEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDR 50 DVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSE 100 SPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPP 150 GPPGLGGNFAPQLSYGYDEKSTGGISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQG 200 FQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPPGPPGKNGDDGEAGKPGRPGERGPPGPQ 250 GARGLPGTAGLPGMKGHRGFSGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQ 300 MGPRGLPGERGRPGAPGPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVG 350 AKGEAGPQGPRGSEGPQGVRGEPGPPGPAGAAGPAGNPGADGQPGAKGAN 400 GAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGE 450 PGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADG 500 VAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPD 550 GKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGV 600 PGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAG 650 PPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGAN 700 GAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGP 750 KGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPG 800 DRGEPGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPP 850 GPIGNVGAPGAKGARGSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGP 900 AGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPG 950 PQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPM 1000 GPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGA 1050 PGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPAGARGPAGPQGPRGDKGETG 1100 EQGDRGIKGHRGFSGLQGPPGPPGSPGEQGPSGASGPAGPRGPPGSAGAP 1150 GKDGLNGLPGPIGPPGPRGRTGDAGPVGPPGPPGPPGPPGPPSAGFDFSF 1200 LPQPPQEKAHDGGRYYRADDANVVRDRDLEVDTTLKSLSQQIENIRSPEG 1250 SRKNPARTCRDLKMCHSDWKSGEYWIDPNQGCNLDAIKVFCNMETGETCV 1300 YPTQPSVAQKNWYISKNPKDKRHVWFGESMTDGFQFEYGGQGSDPADVAI 1350 QLTFLRLMSTEASQNITYHCKNSVAYMDQQTGNLKKALLLKGSNEIEIRA 1400 EGNSRFTYSVTVDGCTSHTGAWGKTVIEYKTTKTSRLPIIDVAPLDVGAP 1450 DQEFGFDVGPVCFL Propéptido N-terminal Helicoide Propéptido C-terminal

64 GKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVM GFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPA
GKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSP GFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAP GPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGAN Fragmento de secuencia del colágeno aI(1) (Muchos residuos de Pro aparecen hidroxilados)

65 Helicoide de poliprolina

66 (fragmento, 14 aa/helicoide)
Cada helicoide es levógiro, pero se entrelazan en forma dextrógira Helicoide triple del tropocolágeno (fragmento, 14 aa/helicoide)

67 Tropocolágeno (fragmento) Vista lateral Vista frontal

68 Helicoide aislado del tropocolágeno
Glicina cada tres residuos Enlaces H a otras cadenas (grupo -C=O peptídico) Helicoide aislado del tropocolágeno

69 Residuos de Gly en tropocolágeno

70 Hidroxilación de prolina
Enzima: procolágeno:prolina monooxigenasa (prolil hidroxilasa), requiere ácido ascórbico La hidroxilación de prolina favorece la formación de enlaces H entre las cadenas

71 Hidroxilación de lisina
Enzima: Procolágeno:lisina monooxigenasa (lisil hidroxilasa), requiere ácido ascórbico La lisina hidroxilada es el punto de unión de oligosacáridos al colágeno

72 Al-Lisina Enzima: lisil aminooxidasa Forma enlaces cruzados
(entrecruzamientos) covalentes entre los helicoides del colágeno

73 Formación de entrecruzamiento covalente entre cadenas de
colágeno a través de lisina y al-lisina, (vía base de Schiff)

74 Formación de entrecruzamiento covalente entre cadenas de
colágeno a través de dos al-lisinas, (vía condensación aldólica)

75 Tipos de colágeno Tipo I [a1(I)]2a2(I) Mayoritario (huesos, piel, tendones) Tipo II [a1(II)]3 Cartílago, vítreo Tipo III [a1(III)]3 Vasos sanguíneos, cicatrices Tipo IV [a1(IV)]3 Membrana basal, cristalino [a2(IV)]3 Tipo V [a1(V)]2a2(V) Superficies celulares [a1(V)]3 [a1(V)][a2(V)][a3(V)] Tipo VI Íntima de la aorta

76 Elastina: Tramos sin estructura definida entrecruzados por desmosina

77 Formación de entrecruzamiento covalente entre cadenas de
elastina a través de cuatro lisinas, (vía formación de desmosina)