REPLICACIÓN DEL ADN. En 1928, Friedrich Griffith utilizó dos cepas de bacterias Streptococus pneumoniae : (cepa S: smooth), cuyas colonias eran de superficie.

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1 REPLICACIÓN DEL ADN

2 En 1928, Friedrich Griffith utilizó dos cepas de bacterias Streptococus pneumoniae : (cepa S: smooth), cuyas colonias eran de superficie lisa y producían la muerte de ratones. (cepa R no encapsulada (rough), cuyas colonias tienen una superficie rugosa y que no mataban a los ratones. Observaciones de Griffith: ● La cepa S producía infección letal en los ratones de su laboratorio y los de la cepa R, no lo hacían. ● Las cepas S muertas por calor son también inofensivas, excepto cuando se las mezcla con cepa R vivas. ● En este último caso, se puede producir una infección fatal y en los ratones infectados se encuentran células vivas con cápsulas características de la cepa S. ● Este experimento permite inferir que algún factor de la cepa S muerta pasa a las cepas R vivas y las transforma en cepas infecciosas letales. ● Griffith no supo cual era ese factor. Experimentos de Griffith *

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4 Experimento de Avery (1944) El neumococo tipo R (rough, rugoso) (colonias a la izda.) puede ser transformado en neumococo tipo S (smooth, liso) (colonias a la dcha.) por el DNA del neumococo S. Esta transformación se transmite a la descendencia. *

5 ● En los años 40, Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCarty revisaron el experimento de Griffith y concluyeron que el factor de transformación era el ADN. ● Oswald Avery repitiendo el trabajo de Griffith con el agregado de una enzima que destruía el ADN, demostró que el factor de transformación era el ADN. ● Cuando Avery agregaba esta enzima, no observaba la transformación obtenida por Griffith. ● Concluyó que el material hereditario era ADN y no una proteína. ● Su evidencia era fuerte pero no totalmente concluyente, para esa época el "candidato principal" para ser el material hereditario eran una proteína. *

6 En los años 40 (19..), Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCarty revisaron el experimento de Griffith y concluyeron que el factor de transformación era el ADN. Oswald Avery repitiendo el trabajo de Griffith con el agregado de una enzima que destruía el ADN, demostró que el factor de transformación era el ADN. Cuando Avery agregaba esta enzima, no observaba la transformación obtenida por Griffith. El concluyó que el material hereditario era ADN y no una proteína. Su evidencia era fuerte pero no totalmente concluyente, para esa época el "candidato principal" para ser el material hereditario eran una proteína. *

7 Replicación del ADN ● Es el proceso necesario para que se realice la división celular. ● Ocurre en la fase S del ciclo celular. ● El mecanismo de replicación se basa en la complementariedad de bases. ● Inicialmente se plantearon tres posibles modelos de replicación: o Modelo conservativo o Modelo dispersivo o Modelo semiconservativo

8 Posibles modelos en la replicación del ADN CONSERVATIVO DISPERSIVO SEMICONSERVATIVO

9 Replicación del ADN – Características generales ● Proceso de duplicación del ADN mediante un modelo semiconservativo. ● Comienza en sitios específicos (orígenes de replicación) ● El proceso de replicación es bidireccional ● Las dos hebras nuevas se van alargando progresivamente, por adición secuencial de nucleótidos ● La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongación del DNA. ● Como las dos hebras de ADN son antiparalelas, una de las hebras se sintetiza de forma continua y otra de forma discontinua. ● El proceso de duplicación está catalizado por las enzimas ADN polimerasas (aunque intervienen muchas otras enzimas en el proceso) ● Hay una corrección de errores para asegurar la fidelidad de las copias

10 Replicación en procariotas ● El proceso se ha estudiado en la bacteria E. Coli ● Consta de las siguientes fases: ● Iniciación ● Elongación ● Terminación ● Durante la elongación se da una corrección de errores ● El proceso de replicación de DNA es el mecanismo que permite al DNA duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). ● Esta duplicación se produce según el modelo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del DNA original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde.

11 Fase de iniciación Los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. ● Procariontes: Un origen de replicación. ● Eucariontes: Múltiples orígenes de replicación. El DNA se replica desenrollando la hélice y rompiendo los puentes de hidrógeno entre las hebras complementarias. La replicación comienza en sitios específicos del ADN conocidos como “origen de replicación” o región oriC.

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13 El DNA se replica desenrollando la hélice y rompiendo los puentes de hidrógeno entre las hebras complementarias. Se forma la burbuja de replicación, con dos horquillas de replicación, que se van extendiendo en las dos direcciones: replicación bidireccional Comienza la fase de elongación.

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15 Fases de la replicación: iniciación Consiste en el desenrollamiento y apertura de la doble hélice de ADN Ori C Proteínas específicas La helicasa rompe los enlaces de hidrógeno entre las bases y abre la doble hélice Proteínas SSB Helicasa Topoisomerasa Girasa Evitan las tensiones debidas a un superenrrollamiento Impiden que el ADN se vuelva a enrollar Las proteínas específicas se unen al punto de iniciación Burbuja de replicación

16 Resume n ● Reconocimiento del OriC por proteínas especificas ● Las helicasas rompen los puentes de H ● Las girasas y topoisomerasas alivian las tensiones del desenrollamiento. 4.Las proteínas SSB evitan que se vuelvan a unir las cadenas sencillas y se enrollen de nuevo 5.Formación de la burbuja de replicación

17 Fase de elongación Se sintetiza la nueva hebra de ADN sobre la hebra original. Se debe a la actuación de las ADN polimerasas. En procariotas hay tres y su función es doble: ● Actividad polimerasa. Va uniendo los desorribonucleotidos trifosfatos complementarios a la cadena original. ● Actividad exonucleasa. Elimina nucleótidos mal emparejados y trozos de ARN cebador

18 La ADN polimerasa no puede actuar desde un principio, necesita un pequeño fragmento sobre el que empezar a añadir nucleótidos. Este primer fragmento es un trozo de unos 10 nucleótidos de ARN llamado cebador o primer, que presenta el extremo 3’ libre El primer es sintetizado por una ARN polimerasa o primasa, que actúa en la zona donde comienza la replicación. A partir de este fragmento, la ADN polimerasa comienza la adición de nucleótidos sobre el extremo 3’ libre. Esta enzima recorre la cadena molde en sentido 5’→3’ y sintetiza la nueva cadena en sentido 3’→5’ (las cadenas de ADN son antiparalelas)

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20 El mecanismo de elongación es distinto en las dos cadenas: ● En una de las cadenas, la hebra conductora, la síntesis es continua. ● En la otra cadena, la hebra retardada, se produce una síntesis a base de pequeños fragmentos de ADN (fragmentos de Okazaki). ● La síntesis de cada uno de los fragmentos de Okazaki necesita de su cebador correspondiente (sintetizado por la primasa). ● Los cebadores serán posteriormente eliminados por la ADN polimerasa I que rellena el hueco con desoxirribonucleotidos. ● Finalmente una ligasa une los fragmentos sueltos.

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22 3’ 5’ 3’ 5’ El mecanismo de elongación 5’ 3’ 5’ 3’ La ADN polimerasa necesita un fragmento de ARN (cebador o primer) con el extremo 3’ libre para iniciar la síntesis. La ADN polimerasa recorre las hebras molde en el sentido 3’-5’ uniendo los nuevos nucleótidos en el extremo 3’. Una de las hebras se sintetiza de modo contínuo. Es la conductora o lider. Fragmentos de Okazaki La otra hebra se sintetiza de modo discontinuo formándose fragmentos que se unirán más tarde. Es la retardada.

23 Terminación del proceso La replicación termina cuando se unen todos los fragmentos de Okazaki de la hebra retardada

24 Corrección de errores ● Durante la replicación se puede producir un error en el apareamiento de bases con una tasa de 1/100.000 bases. ● Parte de estos errores se corrigen durante la replicación. La ADN polimerasa actúa como exonucleasa y elimina los nucleótidos mal apareados y rellena el hueco con los nucleótidos correctos. ● La ADN ligasa une los fragmentos resultantes. ● A pesar de todo, siempre quedan algunos errores (mutaciones)

25 Existen cinco tipos de ADN polimerasas ( , , , , y  ). EnzimaAcciónFunción en la célula. DNA Polimerasa I Añade nucleótidos a la molécula de DNA en formación. Remueve cebadores de RNA. Llena huecos en el DNA, para reparación. Remueve los cebadores de RNA. DNA Polimerasa III Añade nucleótidos a la molécula de DNA en formación. Revisa y corrige la secuencia. Replica DNA. DNA girasa (topoisomerasa II) Promueve el superenrrollamiento. Mantiene la compactación del DNA. DNA helicasa Se une al DNA cerca de la horquilla de replicación. Promueve la separación de las hebras de DNA. Topoisomerasa I Relaja el DNA superenrrollado. Mantiene el nivel adecuado de enrollamiento. Primasa Hace cadenas pequeñas de RNA usando DNA como molde. Necesaria para que la DNA polimerasa replique la hebra “retrasada”.

26 Replicación en los eucariontes Es muy parecida a la de los procariontes, salvo en algunas diferencias debidos a las propias diferencias en el material genético de procariotas y eucariotas: ● El material genético de eucariotas esta dividido en varios cromosomas, mucho mas largos que el cromosoma procariota. ● La replicación se origina simultáneamente en muchos puntos: los replicones (puede haber mas de 6000 en un solo cromosoma). ● Existen cinco tipos de ADN polimerasas (alfa, beta, gamma, delta y épsilon). ● El ADN eucariota está asociado a histonas, que se tienen que duplicar durante la duplicación para formar los nucleosomas.

27 5’ 3’ 5’ 3’ Replicación en los eucariontes Cuando se elimina el último cebador, la ADN polimerasa no podrá rellenar el hueco, al no poder sintetizar en dirección 3’ - 5’. 5’ 3’ 5’3’ 5’ Cebador Último cebador Telómer o Eliminación de cebadores Esto se asocia al envejecimiento y muerte celular. La ADN polimerasa polimeriza desde el extremo 3’ libre Hebra más corta 5’ Debido a esto el extremo del cromosoma (telómero) se va acortando cada vez que la célula se divide.

28 ●28 Tipos de cambios en el DNA

29 ●29 Base molecular de la mutación espontánea  Errores espontáneos durante la replicación Las formas tautoméricas producen transiciones Alineamiento incorrecto  Lesiones espontáneas del DNA Despurinación (pérdida enlace glucosídico azúcar) Desaminación (pérdida grupo amino) Daño por oxidación: radicales hidroxilos, superóxido, peróxido de hidrógeno Mutación en el DNA

30 ●30 La tautomería Emparejamiento normal de las formas normales “ceto”

31 ●31 La tautomería Bases apareadas de manera incorrecta

32 ●32 La tautomería Bases apareadas de manera incorrecta

33 ●33 La tautomería Los desplazamientos tautoméricos causan mutaciones

34 ●34 Alineamiento incorrecto Las mutaciones indel causan un desplazamiento del marco de lectura

35 ●35 Lesiones espontáneas Despurinización del DNA

36 ●36 Lesiones espontáneas Desaminación del DNA

37 ●37 Lesiones espontáneas Acción de los radicales libres sobre el DNA

38 ●38 Mutaciones inducidas Análogos de bases  5-bromouracilo -> análogo a la timina -> aparea con Guanina además de Adenina  2-aminopurina -> análogo adenina -> aparea Timina o Citosina

39 ●39 Análogos de bases  5-bromouracilo -> análogo a la timina -> aparea con Guanina además de Adenina  2-aminopurina -> análogo adenina -> aparea Timina o Citosina Mutaciones inducidas

40 ●40 Agentes químicos Modificación de bases inducidas químicamente (genera emparejamientos incorrectos)  Óxido nitroso (desamina), metilmetano sulfonato (agente alquilante),… Mutaciones inducidas

41 ●41 Agentes químicos Agentes intercalantes: moléculas planas que se intercalan en el DNA  Proflavina, bromuro de etidio, dioxina Mutaciones inducidas

42 ●42 Mutaciones inducidas Agentes físicos  No ionizante -> UV -> Dímeros de timina

43 ●43 Mutaciones inducidas Agentes físicos Radiaciones ionizantes  Roturas cromosómicas - roturas de doble cadena (efectos letales)  Apareamiento incorrecto – roturas del enlace n-glucosídico

44 ●44 Mecanismos de reparación del DNA

45 ●45 Mecanismos de reparación del DNA Reparación directa  DNA fotoliasa: revierte los dimeros de timina - fotorreactivación  Transferasas de grupos alquilo: eliminan los grupos alquilo generados por mutágenos (metanosulfonato de etilo, nitrosoguanidina)

46 ●46 Mecanismos de reparación del DNA Reparación por escisión  Reparación por escisión de bases: Son sistemas de reparación dependientes de homología. Reparan los daños causados por metilación, desaminación, oxidación o pérdida espontanea de bases (Glicosilasas DNA + Endonucleasas AP + Desoxirribofosfodiesterasa + Polimerasa + Ligasa)

47 ●47 Mecanismos de reparación del DNA Reparación por escisión  Reparación por escisión de nucleótidos: Corrige los errores voluminosos que la escisión de base no reconoce (bloqueo de la horquilla de replicación o del complejo transcripcional).

48 ●48 Mecanismos de reparación del DNA Reparación por escisión  Reparación por escisión de nucleótidos: Corrige los errores voluminosos que la escisión de base no reconoce (bloqueo de la horquilla de replicación o del complejo transcripcional).

49 ●49 Mecanismos de reparación del DNA Reparación por escisión  Reparación postreplicativa: corrige emparejamientos erróneos