EPIGENETICA El término fue acuñado por Conrad Waddington (1905-1975, UK) para referirse a las interacciones entre genes y ambiente biólogo del desarrollo,

Presentación del tema: "EPIGENETICA El término fue acuñado por Conrad Waddington (1905-1975, UK) para referirse a las interacciones entre genes y ambiente biólogo del desarrollo,"— Transcripción de la presentación:

1 EPIGENETICA El término fue acuñado por Conrad Waddington ( , UK) para referirse a las interacciones entre genes y ambiente biólogo del desarrollo, paleontólogo, genetista, . embriólogo y filósofo 

2 Lic. Rodrigo Matías González - Tesis Doctoral
EPIGENETICA Modificaciones en el ADN: Modificaciones epigenéticas en general Son modificaciones covalentes sobre el ADN o sobre la cromatina asociada No implican cambios en la secuencia nucleotídica Son mitótica y meióticamente estables Pueden ser adquiridas o perdidas como consecuencia de factores ambientales externos Son mantenidas por complejas maquinarias enzimáticas en algunos casos, transmisibles a la línea germinal y heredables transgeneracionalmente Attwood et al., Cell Mol Life Sci, 2002 Modificaciones en histonas: enmascara carga (+) de lisina Latham & Dent, Nat Struct Mol Biol, 2007 Lic. Rodrigo Matías González - Tesis Doctoral 2

3 MAQUINARIAS ENZIMÁTICAS (para metilación en citosinas en contextos GC) en ANIMALES
Citosina metil transferasas (DNMTs), de novo (ej. DNMT3 en mamíf) que se activan por alguna señal; esenciales (ratón KO letal embrionario) se llama DNMT2 en insectos y de mantenimiento (DNMT1) que reconocen hebra ya metilada de antes (dsDNA hemi-metilado) y metilan la nueva también hay glicosilasas que desmetilan (indirectamente, a través del intermediario HO-metilC)

4 Metilación en citosinas del ADN en distintos contextos
Epigenética en plantas Metilación en citosinas del ADN en distintos contextos Debida a la enzima Metiltransferasa I (MET1). Sobre la región promotora de los genes, reprime su transcripción. Sobre el cuerpo de los genes, estimula su transcripción. CG Debida a la enzima Cromometilasa 3 (CMT3). Mantiene silenciados los trasposones y otros elementos repetitivos. CNG (N = A, T o C) (EXCLUSIVA DE PLANTAS !!) Debida a la enzima Domains Rearranged Methyltransferase 2 (DRM2) en conjunto con pequeños ARN de interferencia. CNN (asimétrica) (N = A, T o C) (EXCLUSIVA DE PLANTAS !!) Lic. Rodrigo Matías González - Tesis Doctoral 4

5 Mecanismo de mantenimiento de la metilación asimétrica
Lo que se sabe: Caracterización de fenotipos mutantes de MET1 y DRM2 en Arabidopsis: tardía floración debido a hipometilación y expresión del gen FWA (que normalmente está silenciado en tejido vegetativo) (Fujimoto el at 2011, Plant Journal 66, 831–843) Determinación de la estructura tridimensional de la CMT3 de maíz mediante cristalografía de rayos X Falta determinar: Mecanismo de mantenimiento de la metilación asimétrica Caracterización bioquímica de las metilasas DRM1 y DRM2 Al ser asimétrica, es más difícil entender cómo la maquinaria metila usando como molde un hebra que no tiene C Se sabe que intervienen siRNAs, que guían a la metilasa DRM2 Du et al., Cell, 2012 Lic. Rodrigo Matías González - Tesis Doctoral 5

6 C U T mC La reacción de bisulfito sobre ADN genómico total Metodología
Citosinas metiladas se detectan por enzimas de restr. sensibles a o dependientes de metilación o por la técnica de bisulfito, o… Metodología La reacción de bisulfito sobre ADN genómico total C U T mC Bisulfito PCR Reacción diferencial del bisulfito con las citosinas metiladas y no metiladas (da uracilo a partir de las no metiladas) Consta de 3 pasos. Los primeros 2 (sulfonación y desaminación) se engloban en la etapa de conversión, a pH = 5, con temperatura y tiempos variables. El tercer paso es el de desulfonación, en medio alcalino (pH = 13) a 37°C desaminación oxidativa no hay reacción en C5 (↓) ↓ Lic. Rodrigo Matías González - Tesis Doctoral 6

7 las histonas también se metilan…
Histone methyl transferases (HMTs) reciben distintos nombres: sobre H3K9: Suv39 o SET en animales; Kriptonita en plantas sobre H3K27: Polycomb en animales y se desmetilan: sobre H3K27: por la desmetilasa UTX (tritorax) en genes HOX del desarrollo durante diferenciación.

8 Código de histonas en animales

9 marcas estudiadas en el LFBM (FBMC) 2do piso
Código de histonas en plantas En plantas, CG metilado en el cuerpo de gen es marca activadora de transcripción marcas estudiadas en el LFBM (FBMC) 2do piso FCEN Lauria & Rossi, Biochim Biophys Acta , 2011 Lic. Rodrigo Matías González - Tesis Doctoral 9

10 ¿Cómo se mantendría el patrón de metilación en histonas
durante replicación de DNA? modelo de Iglesias y Cerdán Front Plant Sci. 2016 

11 ¿Qué tipo de metilación guía a la otra “primero”?
evidencia: Hongos con hipometilación en DNA generalizada resultaron mutantes en HMTs, no en DNMTs que era lo esperado! → interacción entre ambas maquinarias: de metilación en DNA y en histonas

12 2 tipos de modelos MeH3K9 ----→ HP1-----→ DNMT
el de Michael Carey, Gen Dev 2007: MeH3K9 ----→ HP1-----→ DNMT colocada por HMT condensa coloca Me en C MeCit → MBP → HMT el de Johnson et al, Curr Biol 2007 y Fuks et al, NAR 2003: además de reclutar a DHAC… coloca Me en H3K9, que recluta a HP1: condensa colocada por DNMT Methyl-binding proteins coloca Me en H3K9

13 Marcas epigenéticas durante el desarrollo de mamíferos
controla genes de pluripotencia controla genes de desarrollo corporal controla genes de desarrollo corporal oleada de DNA desmetilacion (influyen factores citopl.) excepto en genes sujetos a imprinting y transposones MEFs Epigenetic gene regulation during mammalian development. Key developmental events are shown together with global epigenetic modifications and gene-expression patterns. Very early in development, DNA methylation is erased. In addition, pluripotency-associated genes begin to be expressed, and developmental genes are repressed by the PcG protein system and H3K27 methylation. During the differentiation of pluripotent cells such as ES cells, pluripotency-associated genes are repressed, potentially permanently, as a result of DNA methylation. At the same time, developmental genes begin to be expressed, and there is an increase in H3K4 methylation. During the early development of PGCs, DNA methylation and repressive histone modifications (such as H3K9 methylation) are also erased. Pluripotency-associated genes are re-expressed during a time window that allows embryonic germ cells to be derived in culture. Imprinted genes are demethylated during this period, and developmental genes are expressed afterwards. Flexible histone marks such as H3K27 methylation enable developmental genes to be silenced for a short time in pluripotent cells. By contrast, DNA methylation enables the stable silencing of imprinted genes, transposons and some pluripotency-associated genes. hay lineas ES humanas a partir de embriones de descarte en fertiliz. in vitro controla genes de pluripotencia Nature (2007), 447: 425 13

14 Resumiendo sin describir las marcas
Del cigoto a adulto ocurren oleadas de expresión y represión génica que resultan en diferenciacion En otras palabras: modificaciones epigenéticas junto con factores de transcripción maestros van definiendo linajes celulares ¿Y cómo? Células de cada linaje (incluyendo el germinal) adquieren (o pierden) una combinación de marcas que se heredan a nivel celular (mitosis), p. ej. mediante la DNMT de mantenimiento Células primordiales germinales (PGCs) pueden mantener marcas (heredadas) que existían en ES cells o resetearlas, que serán transmitidas (DNMT de mantenim., meiosis) por las gametas a la generación siguiente

15 Ejemplo de gen de pluripotencia reprimidos en embrionarias somáticas
Oct-3/4 gen se expresa en ES cells Función: pluripotencia Despues de la implantación, se inactiva por metilación de la H3K9 que lo envuelve Model for Oct-3/4 heterochromatinization. Nucleosomes over the active Oct-3/4 promoter initially contain histone H3 that is acetylated at Lys 9 and Lys 14 . When differentiation is initiated, repressors (including GCNF, which binds the RA receptor element, RARE) associate with the Oct-3/4 promoter, causing transient transcriptional repression . This presumably brings about the binding of G9a, which recruits histone deacetylase molecules (HDACs) by an, as yet, uncharacterized mechanism. Once deacetylated, H3(K9) becomes a substrate for methylation, either by G9a itself, or through the involvement of additional histone methylases. 3me-H3(K9) can then bind the chromodomain protein HP1. DNA methylation is catalysed by Dnmt3a, and perhaps Dnmt3b, which are recruited to the promoter through the involvement of G9a and other effectors, such as HP1 . Prior to de novo methylation, Oct-3/4 can be reactivated (double arrows) when cells are returned to early predifferentiation conditions. Following this step, however, repression seems to be irreversible . Note that this model may not include all of the epigenetic factors that are involved in Oct-3/4 inactivation. Nature Cell Biology (2006), 8: 188 15

16 ¿se puede ir para atrás en el laboratorio?
es decir ir desde somáticas a pluripotentes? Sí; lo hizo Shinya Yamanaka paper pionero: en “Bibliografía”

17 Lo que hizo Yamanaka (2006 ratón; 2007 humano) fue justamente introducir tres o cuatro genes maestros (de pluripotencia), uno de ellos Oct3/4, en fibroblastos embrionarios (MEFs) o de adulto, donde normalmente no se expresan y convertirlos en células madre pluripotentes (iPCs), con patrones epigenéticos y estructura de cromatina similares a los de ES normales!!

18 adaptación frente al estrés provocado por estímulos externos
La epigenética muestra mecanismos adaptativos rápidos: un nexo entre los genes y el ambiente

19 ejemplo de efecto epigenético
en plantas

20 ¿y estos personajes?

21 Detección de marcas de metilación en citosinas por la técnica del bisulfito (que convierte C no metilada en T) diferentes epialelos

22 en plantas: distintos contextos de metilación: CG, CNG, CNN

23 sala de torturas

24 el estrés provoca pérdida de marcas de inactivación en genes de adaptación

25 el estrés afecta a la cromatina: marcas en lisinas (histonas) acompañan a marcas en citosinas (DNA)
Experimentos de ChIP con Ab anti-histonas

26 estrés: correlación de pérdida de marcas epigenéticas con aumento de expresión de genes de respuesta al estrés (y fenotipos visibles de tolerancia y adaptación)

27 ejemplos de estudio epigenético
en animales

28 cuanto más GR hay en hipocampo, menos cortisol hay en sangre y baja la ansiedad
p. ej. cortisol

29 efecto de cuidado maternal (Michael Meaney): explorando los orígenes de la ansiedad
Blanca! Ojo los errores! High! el color aquí debería ser el mismo que cuando eran recién nacidos! Rats raised by mothers that display low licking-and-grooming behaviour exhibit more anxiety-related behaviour than rats raised by high licking-and-grooming mothers.

30 Resumen de los resultados
ratas que amamantan (madres biológicas o adoptivas) con fenotipo “muy maternal” inducen en las crías: a nivel molecular: cromatina laxa y desmetilación de CpG en promotor de gen GR en hipocampo (medido por bisulfito), mayor binding del TF “NGF-1” (medido por ChiP anti-TF seguido de Southern) → bajos niveles de gluco- corticoides en sangre a nivel fenotípico: mayor tolerancia al estrés (menor miedo y ansiedad) en la adultez (adquirido en la lactancia, no heredado) Todo lo contrario con amamantadoras “no cuidadoras” Nicostatin (inhibidor de DHAC → afloja la cromatina) inyectada en hipocampo de las crías hace desaparecer las diferencias entre los 4 grupos de crías, tanto a nivel molecular como fenotípico → efectos mediados por eventos epigenéticos Weaver IC et al. Epigenetic programming by maternal Behavior. Nat Neurosci. (2004) 7: 47-54

31 Conclusiones (de Michael Meaney)
1) algunos fenotipos de comportamiento en el adulto (p ej. los relacionados con grados de temor y ansiedad) no son heredados genéticamente sino que son inducidos por la hembra amamantadora (que obviamente en la mayoría de los casos, es la madre biológica). 2) una actitud cariñosa de las madres en los primeros días de vida repercute favorablemente en la vida emocional de los hijos y que perdura en la vida adulta (también sugiere que es extrapolable a humanos: es decir que una buena contención familiar en los primeros años condiciona en gran medida nuestra estabilidad emocional durante toda la vida). 3) los efectos de ese estimulo sobre las crías durante la lactancia son mediados por eventos epigenéticos. Lo que no estudiaron es el fenotipo “Low o High Licking” de las hembras adultas F1 de los 4 grupos, cuando fueron madres. Hubiera sido interesante....

32 (memoria epigenética)
Herencia epigenética transgeneracional (memoria epigenética)

33 en plantas: es posible porque las germ cells surgen tardíamente (floración), después de que la planta sufre el estrés, ya nacen con la marca epigenética adquirida que tenía la cell somática antecesora

34 ¿y en animales? lo que sigue

35 el gen “pigmento rojo” normalmente se encuentra
en eucromatina de cromosoma X, pero para este trabajo, se usaron moscas mutantes (m4) con una inversión de una gran región, por lo tanto el gen quedó en zona pericentromérica → no se expresa y se aprovecha como reporter endógeno (alelo white): ojos blancos antes del estrés co-localiza con HP1 kinasa p38 Inheritance of Stress-Induced, ATF-2-Dependent Epigenetic Change Seonq et al, Japon Cell 145 (2011)

36 Ojo: el alelo white reporter en G2 vino de la madre, no estresada,
no estresadas no estresadas Generación siguien Ojo: el alelo white reporter en G2 vino de la madre, no estresada, lo cual indica que el macho estresado transmitió un epialelo reactivado cuyo producto remodelador (aflojador de cromatrina) actuó durante el desarrollo sobre, entre otros, el alelo white presente en el complemento genético Generación siguiente (G2) sin estresar! el gen del pigmento se activó Cell Volume 145, Issue

37 y el fenotipo de ojos rojos se sigue heredando en las subsiguientes generaciones…
Figure 7 Multigenerational Transmission of Disrupted Heterochromatin Induced by HS Male w m4 flies and female w m4 flies carrying two w m4 genes were mated (G0). In series #2 experiments, the embryos generated were exposed to HS (37°C for 1 hr) f... Ki-Hyeon Seong , Dong Li , Hideyuki Shimizu , Ryoichi Nakamura , Shunsuke Ishii Inheritance of Stress-Induced, ATF-2-Dependent Epigenetic Change Cell Volume 145, Issue

38 Y en vertebrados? Muy improbable porque las germ cells surgen muy tempranamente en el embrión Cuando el adulto sufre un estímulo que repercute p. ej. en el sistema nervioso, difícilmente las marcas epigenéticas lleguen a las gametas! Pocos ejemplos: dieta rica en grasas en ratón macho parental afecta expresión en hígado de genes de metabolismo en progenie bajo dieta normal!

39 representación informática en colores
- representación informática en colores dependiendo el patrón de expresión F1 con dieta normal 3 meses RNAs de hígado cDNA de un color cDNA de otro color Cell (2010) 143: grupo de Oliver Rando, USA La dieta grasa en los parentales provoca cambios en la expresión de muchos genes de síntesis de colesterol en los F1 (alimentados con dieta normal)

40 no ven diferencias en los epigenomas enteros de las gametas
en el mismo paper: effects of paternal diet on methylation of the Ppara enhancer en hígado (gen regulador de la síntesis de lípidos) Ojo! No midieron nada en los padres antes o después de la dieta grasa! Comparan siempre entre F1 de de distintos cruzamientos En otros experimentos no ven diferencias en los epigenomas enteros de las gametas masculinas parentales Mmmmm! hígado

41 otro paper apuntando en el mismo sentido
Chronic high-fat diet in fathers programs β-cell dysfunction in female rat offspring (2010) Nature 467, 963–966

42 Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations Brian G Dias & Kerry J Ressler Nat Neurosci. Jan 2014; 17(1): 89–96. muestran hipersensibilidad a acetofenona (volatil, olor fuerte) en la progenie F1 de ratones F0 que habían sido expuestos a ese olor experiencia en los padres: simultáneamente al olor tambien se los sometió a un electroshock, generando un reflejo condicionado, de manera que después, la exposición al olor les provoca una reacción mucho más marcada que a animales control no condicionados.

43 recuerdan experiencia
traumática del progenitor

44 desmetilación de gen del olfato (acetofena) en gametas de los padres!

45 Se activa el promotor de un gen del olfato (acetofenona)
(en transgen fusionado a β-gal) solamente en los hijos “naive” de padres expuestos al olor

46 ¿entonces podemos hablar de epigenomas (p. ej. metilomas)?
Pues, claro hombre! Pero hay infinitos: tantos como tipos celulares, momentos y estímulos Metodologías posibles: Alta resolución: Bisulfito genome-wide. Difícil alinear con seq control (sin tratamiento con bisulfito) porque se convierten muchísimas C a T Baja resolución*: fragmentos DNA precipitados con Ab anti-metilcitosina + microarray chip o seq (*ojo: pocas citosinas metiladas en un fragmento tal vez no alcancen para lograr inmunoprecipit.)

47 Epigenética: conceptos importantes
Se ocupa de las marcas químicas (covalentes) en la cromatina, que se mantienen en las divisiones celulares -pero también adquiridas o reversibles- que tienen poderosa influencia en la expresión genética ¿cuáles son? son citosinas y diferentes lisinas de histonas a través de metil transferasas (de novo y mantenimiento) y de las enzimas que remueven tales marcas en embriones de mamíferos en desarrollo: “oleadas” de desmetilación (sobre todo genes de pluripotencia) y metilación (sobre todo en genes del desarrollo tardío y diferenc) en embrión temprano desde cigoto hasta ES cells, y luego, patrones particulares en distintos linajes celulares incluyendo germinales, que recapitulan las oleadas de estadíos muy tempranos del embrión dan plasticidad a los organismos adultos pues les permite adaptarse rápidamente a condiciones nuevas (desfavorables), en comparación con la secuencias génicas que requieren varias generaciones, sujeto a selección natural en plantas (en animales más improbable): las adquiridas (no heredadas) en la adultez son transmisibles a células de línea germinal, generando nuevos epialelos con nuevos patrones de expresión, heredables trans-generacionalmente (Lamarck-like?), lo cual puede tener relevancia en la evolución. En animales hay muy pocos ejemplos convincentes.