La electroforesis en gel es una técnica ampliamente utilizada para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas. La electroforesis en gel de agarosa.

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3 La electroforesis en gel es una técnica ampliamente utilizada para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas. La electroforesis en gel de agarosa se usa rutinariamente para la preparación y el análisis del ADN. La electroforesis en gel es un procedimiento que separa las moléculas en función de su velocidad de movimiento a través de un gel bajo la influencia de un campo eléctrico.

4 El ADN tiene carga negativa +- Power Cuando se coloca en un campo eléctrico, el ADN migrará hacia el positivo Se usa un gel de agarosa para retrasar el movimiento del ADN y separarlo por tamaño.

5 +- Power DNA ¿Qué tan rápido migrará el ADN? Tamaño del ADN El ADN pequeño se mueve más rápido que el ADN grande... la electroforesis en gel separa el ADN según el tamaño small large Depende de la fuerza del campo eléctrico, buffer, densidad del gel de agarosa...

6 Agarose La agarosa es un polímero lineal extraído de algas marinas. D-galactose 3,6-anhydro L-galactose Los geles de agarosa endulzados se han consumido en el Lejano Oriente desde el siglo XVII. La agarosa se usó por primera vez en biología cuando Robert Koch la utilizó como medio de cultivo para la bacteria de la tuberculosis en 1882.

7 Preparación de Gel de agarosa

8 Un gel de agarosa se prepara combinando agarosa con una solución de buffer (TAE buffer) Agarose  Buffer  Se hierve usando microondas

9 Casting tray  Gel combs  Power supply  Gel tank   Cover Electrical leads  Equipamiento

10 Gel casting tray & combs

11 Preparando el Gel

12 AgaroseBuffer Solution Se combina el polvo de agarosa y la solución de buffer Usando un matraz que sea varias veces más grande que el volumen del buffer.

13 Agitar suavemente la solución periódicamente al calentar para permitir que se disuelvan todos los granos de agarosa. Tener cuidado al hervir: la solución de agarosa puede sobrecalentarse y puede hervir violentamente si se ha calentado demasiado tiempo en un horno de microondas. Derritiendo la agarosa

14 Permitir que la solución de agarosa se enfríe ligeramente (~ 60ºC) y luego vierta cuidadosamente la solución de agarosa derretida en la bandeja de colada. Evita las burbujas de aire Vertiendo el Gel

15 Cada uno de los peines de gel debe sumergirse en la solución de agarosa fundida

16 Cuando se enfría, la agarosa se polimeriza, formando un gel flexible. 30-45 minutos. Retire con cuidado los peines y la cinta

17 Colocar el gel en la cámara de electroforesis

18 buffer  Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.  Cathode (negative) Anode  (positive)  wells  DNA 

19 6X Loading Buffer:   Bromophenol Blue (for color)  Glycerol (for weight) Preparación de la muestra Mezclar las muestras de ADN con el buffer de carga de muestra 6X (con colorante de seguimiento). Esto permite que se vean las muestras cuando se cargan en el gel, y aumenta la densidad de las muestras, lo que provoca que se hundan en los pozos de gel.

20 Cargando el gel Colocar con cuidado la punta de la pipeta sobre un pocillo y expulsar suavemente la muestra. La muestra debe hundirse en el pozo. Tener cuidado de no perforar el gel con la punta de la pipeta.

21 Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in the electrophoresis chamber. Corriendo el gel

22  wells  Bromophenol Blue Cathode (-) Anode (+) Gel After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA. DNA (-) 

23  100  200  300  1,650  1,000  500  850  650  400  12,000 bp  5,000  2,000 DNA Ladder Standard Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs. - + DNA migration bromophenol blue  Note: bromophenol blue migrates at approximately the same rate as a 300 bp DNA molecule

24 Staining the Gel El bromuro de etidio se une al ADN y es fluorescente bajo luz ultravioleta, lo que permite la visualización del ADN en un gel. El bromuro de etidio se puede agregar al gel y / o al buffer en funcionamiento antes de que se disperse el gel o se puede teñir el gel después de que se haya aplicado ***¡PRECAUCIÓN! El bromuro de etidio es un potente mutágeno y es moderadamente tóxico. Los guantes deben ser usados ​​ todo el tiempo.

25 Alternativas más seguras al bromuro de etidio  Methylene Blue  BioRAD - Bio-Safe DNA Stain  Ward’s - QUIKView DNA Stain  SyBr Safe  Gelred o GelGreen ventajas Barato Menos tóxico No se requiere luz ultravioleta Sin eliminación de residuos peligrosos desventajas Menos sensitivo Se necesita más ADN en el gel Tiempo de tinción / decoloración más prolongado

26 Staining the Gel Colocar el gel en la bandeja de tinción Permitir que el gel se tiña durante 25-30 minutos. Reemplace el agua varias veces para un desteñido eficiente.

27 Ethidium Bromide requires an ultraviolet light source to visualize

28 Visualizing the DNA (ethidium bromide)  100  200  300  1,650  1,000  500  850  650  400  5,000 bp  2,000 DNA ladder  DNA ladder  PCR Product 1 2 3 4 5 6 7 8 wells  + - - + - + + - Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for Wolbachia DNA Primer dimers 

29 Visualizing the DNA (QuikVIEW stain)  250  1,500  1,000  500  750  2,000 bp DNA ladder  PCR Product wells  + - - - - + + - - + - + March 12, 2006 Samples # 1, 6, 7, 10 & 12 were positive for Wolbachia DNA

30  Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico INBIOMEDIC