ELECTROFORESIS ● Método de separación de proteínas en disolución cuando se las somete a un campo eléctrico estacionario Al cerrar el interruptor aparece.

Presentación del tema: "ELECTROFORESIS ● Método de separación de proteínas en disolución cuando se las somete a un campo eléctrico estacionario Al cerrar el interruptor aparece."— Transcripción de la presentación:

1 ELECTROFORESIS ● Método de separación de proteínas en disolución cuando se las somete a un campo eléctrico estacionario Al cerrar el interruptor aparece un campo eléctrico. Las proteínas están cargadas y aparece una fuerza eléctrica que las hace moverse. Debido a la diferente masa, unas proteínas se desplazan más que otras.

2 ELECTROFORESIS (II) ● Al aplicar un campo eléctrico aparece sobre las proteínas una fuerza eléctrica ● Las moléculas del disolvente, polarizadas o ionizadas, apantallan parte de la carga de la proteína (ATMÓSFERA IÓNICA) Carga aparente Carga real Radio efectivo de la proteína Fuerza iónica de la disolución Constante que depende de la Temperatura

3 ELECTROFORESIS (III) ● La fuerza eléctrica es algo menor: ● Además de la fuerza eléctrica aparece una fuerza viscosa, que se opone al movimiento y hace que se alcance una velocidad límite: Velocidad límite Coeficiente de fricción molecular Dirección del movimiento Fuerza viscosa

4 ELECTROFORESIS (IV) ● El coeficiente de fricción molecular es: ● La capacidad de la MICELA para moverse se representa por la MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA, u: Radio efectivo de la MICELA Viscosidad del fluido

5 ELECTROFORESIS (V) ● La capacidad de la MICELA para moverse se representa por la MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA, u: Depende de: ● q': Carga aparente que a su vez depende del tamaño de la proteína, de la T y de la fuerza iónica ● factor de forma de la proteína: 6  R' ● coeficiente de viscosidad del medio:  Depende de 

6 ELECTROFORESIS (VI) ● Electroforesis libre o de Frontera ● Separación e identificación de las proteínas de una mezcla ● Medida de la concentración de las distintas proteínas de la mezcla ● Determinar la movilidad electroforética de una proteína ● Electroforesis de zona ● Las mismas que la electroforesis libre ● Extracción de proteínas de una mezcla Tipos y aplicaciones

7 ELECTROFORESIS (VII) Electroforesis libre o de Frontera Aparato de Tiselius (I) + - ELECTRODOS DISOLUCIÓN TAMPÓN TUBO DE ELECTROFORESIS Frontera entre la disolución de proteínas y la disolución tampón El sistema se encuentra a T constante para evitar corrientes de convección

8 ELECTROFORESIS (VIII) Electroforesis libre o de Frontera Aparato de Tiselius (II) + -

9 ELECTROFORESIS (IX) Electroforesis libre o de Frontera Aparato de Tiselius (III) + - ● Elección cuidadosa del medio en el que disolvemos las proteínas ● pH: Condiciona la ionización de las proteínas (movilidad) ● Disolución tampón: Para mantener el pH constante y conocer con precisión la fuerza iónica de la disolución ● D.D.P utilizada: Debe ser lo mayor posible, pero sin que la cantidad de calor liberada (Efecto Joule) altere las proteínas

10 ELECTROFORESIS (X) Electroforesis libre o de Frontera ● Análisis cualitativo de una mezcla El diagrama electroforético consta de una serie de picos, cada uno de los cuales corresponde a una movilidad diferente. Comparando con patrones podemos identificar las distintas proteínas presentes en la mezcla.

11 ELECTROFORESIS (XI Electroforesis libre o de Frontera ● Análisis cuantitativo de una mezcla Diagrama electroforético: Gradiente de concentración frente a posición El área bajo un pico respecto al área total da la concentración de dicha proteína

12 ELECTROFORESIS (XII) Electroforesis libre o de Frontera ● Medida de la movilidad electroforética (Disolución con 1 proteína) ● Se realizan dos diagramas electroforéticos separados un intervalo de tiempo. ● Cálculo de la velocidad límite ● Cálculo del campo eléctrico

13 ELECTROFORESIS (XIII) Electroforesis de zona ● La migración de las proteínas se realiza sobre un medio rígido (papel o gel), lo que permite separarlas en zonas bien diferenciadas, pudiendo ser extraidas por elución. ● Permite trabajar con cantidades pequeñas ● Permite separar compuestos ionizables de masa molecular pequeña: aminoácidos, nucleótidos,...

14 ELECTROFORESIS (XIV) Electroforesis de zona

15 ELECTROFORESIS (XV) Electroforesis de zona Tipos ● Electroforesis sobre papel: el medio rígido es un papel de filtro empapado en la disolución tampón sobre el que se coloca la disolución de proteínas. ● Electroforesis sobre gel: el medio rígido es un gel (almidon, acetato,...) sobre el que se coloca la disolución de proteínas.

16 ELECTROFORESIS (XVI) Electroforesis de zona

17 ELECTROFORESIS (XVII) Electroforesis de zona Fuente de alimentación Baño térmico Tiras de gel Electrodos

18 ELECTROFORESIS (XVIII) Información más avanzada: ● http://webpages.ull.es/users/fcorzo/electroforesis/indice.htm http://webpages.ull.es/users/fcorzo/electroforesis/indice.htm ● Curso de Doctorado de la Univ. De la Laguna ● http://iqb.fcien.edu.uy/pdf/electroferosis.pdf http://iqb.fcien.edu.uy/pdf/electroferosis.pdf ● Notas sobre electroforesis ● http://www.amershambiosciences.com http://www.amershambiosciences.com ● Empresa de productos para laboratorio

19 ELECTROFORESIS ● Método de separación de proteínas en disolución cuando se las somete a un campo eléctrico estacionario - + - + - +++ E