Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis V Semestre Asignatura: Práctica Profesional II COLORACIONES de uso frecuente en Microbiología.

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1 Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis V Semestre Asignatura: Práctica Profesional II COLORACIONES de uso frecuente en Microbiología Profa. Maribel Castellano Licenciada en Bioanálisis Magister Scientiarum en Microbiología Doctora en Ciencias de la Salud

2 2  Los colorantes son sustancias que, por procedimientos apropiados, tienen la capacidad de transmitir su color a otros cuerpos.  Generalmente, son sales que al disociarse originan iones cargados positiva y negativamente.  Uno de estos iones es el que imparte la propiedad cromógena y se denomina, entonces, cromóforo.  El otro, se denomina auxocromo y es el que permite que el colorante se una a las fibras o tejidos. Colorantes

3 3 Tipos de Colorantes a) Sales Colorantes  Se consideran ácidos o básicos; lo cual no necesariamente indica su reacción en solución (pH); sino más bien, si una parte significativa de la molécula es aniónica o catiónica. Si el cromóforo es el ión positivo, el colorante se denomina básico (catiónico), y si es el negativo, ácido (aniónico). b) Colorantes liposolubles  Se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usados para revelar la localización de los depósitos de grasa.  Ejemplo: Sudán Negro

4 4 Tipos de Colorantes  Tiñen la célula bacteriana uniformemente  Más usados en citología bacteriana  Ejemplos: azul de metileno; safranina; fucsina básica; cristal violeta (violeta de genciana); verde de malaquita, entre otros. Colorantes básicos Colorantes ácidos  Son poco utilizados, debido a que su cromóforo repele las cargas negativas de la superficie bacteriana.  Se usan generalmente, cuando se desea teñir estructuras citoplasmáticas o efectuar tinciones negativas.  Ejemplos: eosina; tinta china; nigrosina; rojo Congo

5 5 Coloraciones/Tinciones  La introducción de tinciones a mediados del siglo XIX representa, en gran medida, el fundamento de los principales avances que se han producido en la Microbiología durante los últimos siglos  Permiten estudiar la forma y disposición celular de los microorganismos  Las tinciones consisten en aplicar soluciones acuosas o alcohólicas de colorantes a los microorganismos, tejidos vegetales y animales, así como también otras sustancias de importancia biológica.  Colorear significa, simplemente, teñir los microorganismos para enfatizar ciertas estructuras.

6 Etapas del Proceso de Coloración En el proceso de coloración se cumplen siempre las siguientes etapas: 1.-Preparación del frotis o extendido. 2.-Fijación del frotis o extendido. 3.-Aplicación de colorantes o coloración propiamente dicha.

7 Preparación del Frotis o Extendido  Consiste en colocar el material a examinar sobre el portaobjeto.  El extendido debe ser delgado, uniforme y no llegar a los bordes de la lámina  Debe dejarse secar al aire

8 Preparación del Frotis o Extendido 1.Colocar una gota de SSF (0,85%) estéril en el centro de un portaobjetos limpio y libre de grasa 2.Con un asa, previamente esterilizada a la llama del mechero, tomar el crecimiento bacteriano 3.Resuspender en la SSF, con ayuda del asa. Extender la suspensión bacteriana sobre un área pequeña del portabjetos (1 cm) 4.Esterilizar nuevamente el asa a la llama del mechero 5.Dejar secar al aire Si el frotis se va a preparar a partir de un cultivo en caldo, obviar el agregado de SSF

9 Fijación del Frotis o Extendido  Se efectúa con la finalidad de adherir los microorganismos al portaobjetos de manera que no se desprendan en las etapas posteriores de la coloración  Permite que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio, alterando lo menos posible, su morfología y disposición  Puede hacerse por métodos físicos (calor moderado) o químicos (alcohol)  Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los frotis de colonias en medios sólidos, se fijan generalmente con calor.

10 Fijación del Frotis por Calor 1.Una vez que el frotis se ha secado al aire, debe fijarse pasándolo varias veces (3-4) sobre la llama azul del mechero, con la cara del frotis mirando hacia arriba y evitando el sobrecalentamiento. 2.Comprueba la temperatura alcanzada (< 45 ° C), colocando la cara limpia del portaobjetos sobre la eminencia tenar de la mano (base del pulgar)  Alternativamente, puede utilizarse una plancha de calentamiento a 60 ° C x 10 ’.  La fijación por calor preserva la morfología global; pero no las ultraestructuras.

11 Fijación del Frotis por Métodos Químicos  Se utiliza para proteger las subestructuras celulares finas y la morfología de los microrganismos más grandes.  Los fijadores químicos penetran en la célula y reaccionan con los componentes celulares, normalmente se unen a proteínas y lípidos para inactivarlos, insolubilizarlos e inmovilizarlos.  Las mezclas comunes de fijadores contienen sustancias como etanol, ácido acético, cloruro de mercurio, formaldehído y glutaraldehído.

12 Fijación del Frotis por Métodos Químicos  Una vez que el frotis se ha secado al aire, debe cubrirse la lámina con alcohol (metanol al 95% ); (hacer esto en zonas alejadas del mechero)  Dejar actuar x 2 ’  Escurrir el exceso  Dejar secar al aire antes de proseguir con la coloración

13 Coloración propiamente dicha  Consiste en la aplicación del o los colorantes sobre el frotis ya fijado

14 Tipos de Coloración  Coloración simple  Coloración diferencial  Especial o estructural

15 Tipos de Coloración Coloración simple:  Es la que emplea únicamente un (1) colorante que se aplica al frotis en una sola operación.  Su uso revela la morfología y disposición celular de las bacterias; sin embargo, no muestra detalles finos de su estructura interna.  El tiempo necesario para la coloración varía con la dilución del colorante.  Una vez teñidos, los extendidos son lavados brevemente con agua para eliminar el exceso de colorante, secados al aire o con papel secante y después de ello, quedan listas para ser observadas al microscopio óptico con objetivo de inmersión (100x).  Las coloraciones simples más utilizadas en bacteriología son: azul de metileno, azul de toluidina, safranina, fucsina y violeta de genciana.

16 Tipos de Coloración Coloración diferencial:  Es aquella que emplea 2 ó más colorantes juntos o separados, según la técnica que se trate.  Permite distinguir entre dos clases diferentes de microorganismos o entre dos partes diferentes de un mismo organismo.  Las dos coloraciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, son sin lugar a dudas, la coloración de Gram y la coloración de Ziehl-Neelsen.

17 Componenentes de una Coloración Diferencial  El colorante primario, usualmente, tiñe del mismo color, todos los componentes celulares y microorganismos presentes en el espécimen.  Ocasionalmente, se añade un químico a la solución para intensificar la tinción. Tal aditivo se conoce como mordiente y su función es incrementar la afinidad del colorante por la muestra biológica. Otra función sería la de recubrir estructuras, por ejemplo, los flagelos, para hacerlos más gruesos y fáciles de visualizar después de teñidos. Son ejemplos de mordientes: calor, lugol y fenol.  Los agentes decolorantes, típicamente, son alcoholes y ácidos. Remueven el colorante primario.  La remoción del colorante primario por acción del decolorante permite la tinción, con el colorante de contraste, de las células que fueron decoloradas; así como también del fondo.

18 Tipos de Coloración Coloración especial o estructural:  Es una coloración diferencial que, como su nombre lo indica, permite colorear, de manera particular, estructuras especiales de la célula bacteriana, como por ejemplo: cápsula, flagelos, endosporas, gránulos metacromáticos y otros constituyentes intracelulares de las células bacterianas.

19 Coloración de Gram  Se fundamenta en la estructura y composición química de la pared celular  La diferencia fundamental entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas radica en la cantidad de lípidos presentes en los dos tipos de paredes celulares.  Cuando se agrega el colorante primario y el mordiente durante el proceso de la coloración, el cristal violeta y el iodo forman complejos que se encuentran sobre todo en el interior de la célula.  Cuando se agrega el decolorante, como la pared celular Gram positiva tiene una baja concentración de lípidos; pero una capa gruesa de peptidoglucano, el alcohol- acetona deshidrata la pared celular y atrapa los complejos cristal violeta-iodo en el interior celular, lo que le confiere a la bacteria un color violeta.  En contraste, la pared celular Gram negativa, está formada por lípidos, lipopolisacáridos y lipoproteínas, presentes en su membrana externa. Además, poseen una delgada capa de peptidoglucano. La solubilidad de los lípidos en el alcohol permite que el decolorante extraiga el colorante primario de la membrana externa sin que la pared celular constituya una barrera impermeable. Por tanto, en ese momento, sale el cristal violeta del interior de la bacteria y es preciso volver a teñir la célula con safranina para poder visualizarla, apareciendo entonces, coloreadas de rojo-rosado. Fundamento

20 Coloración de Gram Fijación Cristal violeta 1’ Lugol 1’ Alcohol-acetona 10-20’’ Safranina 30’’ Gram positivo Gram negativo Morfología Agrupación Afinidad tintorial Lavar Dejar secar al aire Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100x) Reporte

21 Coloración de Ziehl Neelsen Fundamento Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo

22 Coloración de Ziehl Neelsen

23 Coloración de gránulos metacromáticos  Los gránulos metacromáticos son inclusiones citoplasmáticas de polifosfato y se conocen también como gránulos de volutina o cuerpos de Babés- Ernst.  Se llaman así porque muestran un efecto metacromático; esto es, aparecen de un color rojo o diferentes tonos de azul cuando se tiñen con azul de metileno o azul de toluidina  Son comunes en corinebacterias, espirilos y bacilos lácticos  Su presencia se utiliza en la identificación bacteriana  Tienen una fuerte afinidad por los colorantes básicos, como la fucsina básica, el cristal violeta, el azul de metileno o el verde de malaquita

24 Coloración de gránulos metacromáticos Azul de metileno de L ö effler 1.Elaborar un frotis de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae en medio de L ö effler o de cualquier otra bacteria productora de gránulos metacromáticos. 2.Dejar secar al aire. Fijar el frotis a la llama del mechero. 3.Cubrir la lámina con una solución alcohólica de azul de metileno. Dejar actuar por cinco (5) minutos 4.Lavar la preparación con agua corriente. Escurrir la lámina y dejar secar al aire 5.Observar la preparación con objetivo de inmersión (100x).  Los gránulos metacromáticos aparecen de color azul oscuro y el resto de la bacteria de color azul claro

25 Coloración de gránulos metacromáticos Albert 1.Preparar y fijar el frotis o extendido. 2.Cubrir el portaobjeto con el azul de toluidina-verde de malaquita. Dejar actuar por 3-5 minutos 3.Lavar con agua corriente. Escurrir 4.Aplicar la solución II (Iodo). Dejar actuar por 1 minuto 5.Lavar con agua corriente 6.Secar con papel absorbente o dejar secar al aire. 7.Observar con objetivo de inmersión (100x).  Los gránulos metacromáticos aparecen de un color azul café verdoso oscuro y el resto de la bacteria de verde

26 Coloración de Esporas Coloración de Wirtz-Conklin 1. Colocar un frotis seco no fijado sobre un soporte para coloración, someter a calentamiento sobre un vaso de precipitado conteniendo agua hirviente (Alternativamente, puede colocarse la lámina sobre un soporte para coloración y utilizar un mechero). Permitir que el agua de condensación forme gotas en el reverso de la lámina. (Es importante no fijar el frotis antes, ya que el vapor facilita la penetración del colorante. La fijación de la espora previa a la tinción, no permite la acción del vapor). 2. Cubrir la preparación con verde de malaquita 3. Calentar hasta desprendimiento de vapores durante 3 a 6 minutos. Agregar más colorante para evitar que se seque la preparación 4. Dejar enfriar y lavar con agua corriente 5. Colorear con safranina durante 30 segundos 6. Lavar, dejar secar al aire y examinar con objetivo de inmersión

27 Coloración de Esporas Coloración de Wirtz-Conklin Las esporas se presentan como óvalos verdes dentro de bacilos rojos

28 Coloración de Cápsula Coloración de Hiss 1.Preparar una suspensión bacteriana en solución salina fisiológica, a partir de un cultivo puro de Klebsiella pneumoniae. 2.Preparar un extendido, mezclando una asada de la suspensión bacteriana con una gota de suero normal sobre un portaobjetos limpio y libre de grasa. Dejar secar al aire y fijar por calor. 3.Cubrir el extendido con cristal violeta. Calentar hasta desprendimiento de vapores durante un minuto aproximadamente. 4.Enjuagar con sulfato de cobre. Nunca con agua. 5.Escurrir la lámina y dejar secar al aire en posición vertical. 6.Examinar la preparación con objetivo de inmersión (100x).

29 Coloración de Cápsula Coloración de Hiss Las cápsulas aparecerán como un área de color violeta claro alrededor de la célula bacteriana que toma un color violeta intenso

30 Coloración de Cápsula Coloración de Hiss Las cápsulas aparecerán como un área de color violeta claro alrededor de la célula bacteriana que toma un color violeta intenso

31 Coloración de Cápsula Coloración de Anthony 1.Elaborar un extendido delgado en una lámina portaobjeto, a partir de un cultivo puro de Klebsiella pneumoniae en leche descremada. Dejar secar al aire. No fijar con calor. 2.Cubrir la preparación con una solución acuosa de cristal violeta (1%). Dejar actuar por 2 minutos. 3.Lavar la preparación con una solución de sulfato de cobre al 20%. 4.Escurrir la lámina y dejar secar al aire en posición vertical. 5.Examinar la preparación con objetivo de inmersión (100x).

32 Coloración de Cápsula Coloración de Anthony 1.Elaborar un extendido delgado en una lámina portaobjeto, a partir de un cultivo puro de Klebsiella pneumoniae en leche descremada. Dejar secar al aire. No fijar con calor. 2.Cubrir la preparación con una solución acuosa de cristal violeta (1%). Dejar actuar por 2 minutos. 3.Lavar la preparación con una solución de sulfato de cobre al 20%. 4.Escurrir la lámina y dejar secar al aire en posición vertical. 5.Examinar la preparación con objetivo de inmersión (100x).

33 Coloración de Cápsula Coloración Negativa o por Contraste 1.Colocar una pequeña gota de solución salina fisiológica sobre un portaobjetos limpio y agregar una cantidad muy pequeña de un cultivo joven proveniente de un cultivo en agar. 2.Mezclar bien y luego agregar una pequeña gota de tinta china y cubrir inmediatamente con un cubreobjetos delgado dejando que la gota se extienda como una película fina debajo del mismo. 3.Examinar inmediatamente con objetivo de inmersión y bajando el condensador para reducir la luz en forma marcada.

34 Coloración de Cápsula Coloración Negativa o por Contraste En este método, la cápsula desplaza las partículas coloidales de carbón presentes en la tinta china y se presenta como un halo claro, alrededor del microorganismo; es decir, el entorno del microorganismo aparece teñido por efecto del colorante, dejando al organismo incoloro.

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