ESTUDIO DE LA RELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO

Presentación del tema: "ESTUDIO DE LA RELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO"— Transcripción de la presentación:

1 ESTUDIO DE LA RELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO

2 Lo que vamos a hacer en la práctica…
Mínimo 30 min antes de la práctica NO debemos comer, fumar, beber o lavar los dientes.

3 Toma de muestra Enjuagar la boca con agua purificada Enjuagar la boca vigorosamente con 10 mL de solución salina al 0.5% (p/v) por 1 minuto, después escupirla en el mismo vaso. Tomar 1.5 mL de la solución anterior en un microtubo, centrifugar a rpm por 1 min. Recuperar el botón celular (desechar el sobrenadante). Repetir pasos 3 y 4. Resuspender las células en 100 uL del mismo sobrenadanate con vortex. Extracción de DNA Transferir 30uL de las células a un tubo nuevo y agregar 100uL de la suspensión de Chelex al 10% (Agitar el Chelex antes de agregar). Poner a incubar los tubos en un termobloque a 100 °C durante 10 minutos. Retirar los tubos del termobloque y agitar el vortex vigorosamente por 5 segundos. Centrifugar a rpm por 2 minutos. Transferir el sobrenadante, EVITAR ARRASTRAR EL CHELEX (70uL aprox). Prepara la reacción de PCR.

4 VOLUMEN PARA UNA REACCIÓN (μL)
REACTIVO VOLUMEN PARA UNA REACCIÓN (μL) VOLUMEN NECESARIO PARA 60 MUESTRAS (uL) Agua libre de nucleasas 16.25 975  Amortiguador de PCR 10x 2.5 150  MgCl2 1.5 90  Oligo Mix 25X 1 60  Taq Pol 5U/ μL 0.25 15 dNTPs 0.5 30  TOTAL 22 1320  Tomar 22 uL del Master Mix y agregar 3 uL de muestra de DNA. Poner control positivo y control negativo. Correr el PCR con estas condiciones: 95°C por 5 minutos 30 veces las siguientes condiciones: 95°C por 30 segundos 64°C por 45 segundos 72 °C por 45 segundos (Tiempo total de reacción: Aproximadamente 1.5 horas)

5 Digestión de los productos de PCR
Transferir 10 μL de la reacción de PCR a un microtubo, y agregar 0.5 μL de HaeIII (mezclar SUAVEMENTE). Incubar por 1 hora a 37°C. Una vez pasado el tiempo de incubación, correr en un gel de agarosa el producto de la PCR digerido (paso 15), el producto de la PCR sin digerir, el marcador de peso molecular, y los controles positivo y negativo. Preparar las muestras para electroforesis de la siguiente manera: 7 μL de muestra μL de amortiguador (Gel Loading Dye Blue 6X) μL de agua. Marcador: 1 μL de marcador de peso molecular (2-Log DNA ladder) + 2 μL de amortiguador + 9 μL de agua.

6 ✓ DNA eucarionte DNA procarionte ✗

7 GEN Es un segmento de DNA contenido en los cromosomas que determinan las características humanas específicas (estatura, color de ojos, color de pelo).

8 Los genes en conjunto, constituyen el material hereditario.
A la composición genética de un organismo se le denomina Genotipo. Se tienen dos copias de cada gen, llamados alelos, (una en el cromosoma materno y otra en el cromosoma paterno). El gen se encuentra en la misma posición en cada cromosoma.

9 Gen dominante (Alelo dominante): Es aquel que se manifiesta en el fenotipo y siempre se expresa cuando esta presente, sin importar si esta en condición homocigoto o heterocigoto. En genética el gen dominante se refiere al miembro de un par alélico que se manifiesta en un fenotipo, tanto si se encuentra en dosis doble, que fue recibida una copia de cada padre (combinación homocigótica) o como dosis simple, es decir que uno solo de los padres aporto el alelo dominante en su gameto (heterocigosis). Los alelos dominantes se representan con una letra mayúscula.

10 Gen recesivo: El gen recesivo es el miembro de un par alélico que no se manifiesta en el fenotipo cuando el alelo dominante está presente. Para que este alelo se observe deben estar dos copias del mismo, provenientes uno de cada progenitor. En genética el termino de gen recesivo es aplicado al miembro de un par alélico imposibilitado de manifestarse cuando el alelo dominante esta presente. Estos alelos son representados con una letra minúscula.

11 Heterocigoto: Un individuo es heterocigoto cuando los dos genes del mismo locus de cromosomas homólogos (alelos) son diferentes. El individuo posee dos formas (alelos) diferentes del mismo gen, cada una aportado por uno de los progenitores. Homocigoto: Cuando los dos genes del locus de cromosomas homólogos son idénticos para un mismo carácter, es decir tiene dos copias idénticas de ese gen. Un genotipo homocigoto dominante surge cuando una secuencia determinada abarca dos alelos para el atributo dominante. Un genotipo homocigoto recesivo surge cuando la secuencia abarca dos alelos del atributo recesivo.

12 Genotipo: Es el contenido genético de un individuo en forma de ADN (genoma).
Fenotipo: Es el resultado de la interacción del genoma de un individuo con el medio ambiente. Son los caracteres que se expresan externamente.

13 Mutaciones Cambios en la secuencia de ADN, ya sea en un par de bases, un fragmento o cambios en la organización. Es espontánea y puede transferirse a la descendencia. La mutación se refleja en la producción de una proteína nueva, con función alterada o con pérdida de función. Si es una proteína es esencial es una mutación letal. Se le denomina variante cuando la mutación se encuentra en un grupo de individuos dentro de una población. Cambios en la secuencia de nucleótidos por sustitución, perdida o adición en un par de bases (mutaciones puntuales) o en muchos pares de bases (fragmento de DNA cromosómico) o por translocación de secuencias por inserción o transposición.

14 Las mutaciones pueden llevar a que una de las copias de un gen no realice su función de manera apropiada, pero debido a que tenemos dos copias de cada gen, nos quedará una copia “normal” que desempeñara bien su función. En este caso el cuerpo puede seguir funcionando con normalidad (herencia autosómica recesiva). Para que una persona desarrolle una enfermedad recesiva, deberá tener mutaciones en las dos copias del gen, estando las dos copias no funcionales. Los genes pueden ser dominantes o recesivos. Los rasgos dominantes son controlados por un gen en el par de cromosomas. Los rasgos recesivos requieren que ambos genes en el par de genes trabajen juntos.

15 Polimorfismos Los polimorfismos son variaciones en un sitio determinado dentro de la secuencia de DNA de un cromosoma presente en un grupo de individuos de una población y debe estar en por lo menos 1% de la población. Puede ser la sustitución en una sola base (SNP o SNV). De secuencia de bases repetidas (VNTR o STR).

16 SNPs o SNVs Polimorfismo de nucleótido único o simple o SNPs (se pronuncia “snips”), es un tipo de polimorfismo que produce una variación en una sola posición de la secuencia de DNA (un par de bases). Recientemente se le renombró como variante de un nucleótido simple o único (SNV, se pronuncia “snivs”) Son las variaciones genéticas más abundantes en la población. Estás variaciones sirven como marcadores genéticos. Cuando un SNP o SNV produce un cambio en la proteína, se le conoce como “no sinónimos” En los humanos estos polimorfismos estás relacionados con algunas enfermedades, respuesta a fármacos y otros fenotipos, aunque la mayoría no afectan la salud o el desarrollo. Los SNPs (SNVs) ayudan a predecir de manera individual: Respuesta a ciertas drogas Susceptibilidad a factores ambientales (toxinas) Riesgo a desarrollar ciertas enfermedades

17 RFLP`s (Restriction fragment length polymorphisms) o polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción. Técnica de Biología Molecular en la que se usan endonucleasas para cortar fragmentos de DNA de un gen en distintos organismos. Se utiliza para identificar las diferencias de un mismo gen en diferentes organismos. Sirve para analizar fragmentos de secuencias pequeñas de DNA que varían de persona a persona llamadas VNTRs (Número Variable de Repeticiones en Tandem). Los cambios se detectan mediante la presencia o ausencia de fragmentos provocados mediante la restricción. Aplicaciones: En el área jurídica Pruebas de paternidad En Biología Molecular… Identificación de mutaciones entre organismos

18 Marcadores RFLP´s Un marcador es cualquier característica heredable que permite identificar diferencias entre individuos. Estos marcadores se basan en la identificación de las diferencias en el tamaño de los fragmentos generados mediante restricción de endonucleasas. Para detectar estas diferencias es necesario marcar con una sonda marcada. Los polimorfismos surgen como sonsecuencia de las diferencias de las dianas de las enzimas de restricción. El tamaño de los fragmentos esta limitado por dos sitios de restrición dados. Los RFLP`s fueron los primeros marcadores moleculares utilizados para hacer mapeos genéticos.

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20 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

21 En que consiste un PCR … MgCl2 PCR - Buffer ANNEALING = ALINEAMIENTO

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23 Imagen 1. Activación del receptor T2R por sustancias amargas en las células gustativas tipo II localizadas en cavidad oral (preferentemente en lengua), con el incremento subsiguiente de los niveles de Ca2+ intracitoplásmico. PLCb2: fosfolipasa b2; PIP2: fosfatidilinositol bifosfato; DAG: 1,2- diacilglicerol; IP3: inositol 1,4,5-trifosfato; IP3R3: receptor tipo 3 del inositol 1,4,5-trifosfato; TrpM5: receptores de potencial transitorio; Panx1: poros de hemicanales panexina1.

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