PAPEL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL DIAGNÓSTICO HEMATOLÓGICO

PAPEL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL DIAGNÓSTICO HEMATOLÓGICO
Ricardo Molina Gasset Enero 2019

BIOLOGÍA MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
El diagnóstico molecular juega un papel crucial en el diagnóstico y seguimiento de cánceres hematológicos. Primera división celular por Walther Flemming 1882 Descripción por primera vez de un cromosoma llamado Philadelphia en un paciente con leucemia mieloide crónica 1960 Secuenciación completa del genoma de un paciente con leucemia mieloide aguda por Elaine Mardis 2008 Mas100 años

La pérdida de heterocigosidad puede definirse como el fenómeno por el cual un locus (posición precisa de un gen en un cromosoma) pierde una de las copias de un gen, por deleción u otro mecanismo. Este proceso se llama también LOH por sus siglas en inglés (Loss Of Heterozygosity).

Fuente ADN Medula osea Sangre periférica LCR Objetivos: Aislar ADN de las células Purificar el ADN aislado Máxima eficiencia: Cantidad Calidad (contaminación proteíca)

Es Importante Diferenciar dos Conceptos
BIOLOGÍA MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS Es Importante Diferenciar dos Conceptos Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los restos celulares Purificación: Separación de AN: De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos

EL PROBLEMA Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de AN es necesario disponer de éstos en estado puro. Por qué purificar? Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los ácidos nucléicos. Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en ingeniería genética. El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

Etapas básicas de un procedimiento general para Extracción y Purificación de AN Disgregación o fragmentación del tejido Pre-tratamiento (en caso de ser necesario ) Neutralización Tratamiento con solventes orgánicos Estas etapas deben ir acompañadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares Lisis celular Clarificación Purificación Cualitativo: electroforesis Cuantitativo: espectrofotometría UV Análisis

Métodos de fragmentación y lisis celular
BIOLOGÍA MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS Métodos de fragmentación y lisis celular El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN). Métodos físicos Homogenización mecánica, Homogenización en solución Molienda manual en mortero Bolitas de vidrio Sonicación Métodos químicos Detergentes SDS (sodium dodecyl sulfate) CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) Métodos enzimáticos Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamina de peptidoglicán de la pared celular de bacterias Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y membrana plasmática e interacciones célula-célula.

Métodos de purificación y extracción ADN:
BIOLOGÍA MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS Métodos de purificación y extracción ADN: Orgánicos Mediante Sales Matrix de Sílice Resina intercambio-iónico Resinas de afinidad o particulas magnéticas

Purificación de ADN mediante extracción orgánica Fenol-cloroformo SEVAG: Isoamílico-Cloroformo Extracción orgánica, separación de fases ADN Moléculas bipolares Proteínas, restos de membranas, lípidos

Purificación de ADN mediante precipitación de proteínas con sales Agregado de sales LiCl, NaCl, NaClO4 ADN Moléculas bipolares Proteínas, restos de membranas, lípidos

Purificación de ADN Precipitación ADN Lavados con alcoholes de menor grado + ETOH o Centrifu- gación Isopropanol Dilución en buffer TE o H2O

Purificación de ADN mediante matrices de sílice
BIOLOGÍA MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS Purificación de ADN mediante matrices de sílice ADN se une a la matrix de sílice Los contaminantes son eliminados por sucesivos pasos de lavado El ADN es extraido de la matriz con agua DNA eluye de la sílica en agua DNA se une a la sílica en NaCl

Purificación de ADN mediante cromatografía de intercambio aniónico • Cromatografía de intercambio iónico. Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Tecnología de particulas magnéticas
BIOLOGÍA MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS Tecnología de particulas magnéticas

Análisis espectrofotométrico de AN y criterios de pureza
BIOLOGÍA MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS Análisis espectrofotométrico de AN y criterios de pureza Longitud de onda Razón Abs260/Abs230 debe ser mayor de 1.8 (< sugiere contaminación con fenol/CHCl o carbohidratos). Razón Abs260/Abs280 debe ser ~1.8 (< sugiere contaminación con proteínas, Abs320 se debe a difracción de la luz por material particulado en la muestra. Debería ser baja.

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biológico Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza

LEUCEMIAS Grupo heterogéneo de desórdenes neoplásicos de los leucocitos. De acuerdo a su origen se clasifican en: Mieloides Linfoides De acuerdo a su evolución (sin Tx.) Agudas Crónicas

LEUCEMIAS Leucemia linfocítica crónica (LLC): expansión monoclonas de linfocitos (95% linfos B). Leucemia linfoblástica aguda (LLA): Desorden monoclonal maligno de los precursores linfopoyéticos. Leucemia mieloide crónica (LMC): proliferación no controlada de granulocitos Leucemia mieloide aguda (LMA): Trastorno de los precursores de celulas hematopoyéticas. De acuerdo al sistema francés- americano-británico se sub-dividen en 7 grupos.

Etiología La causa de la expansión clonal no se conoce totalmente. Involucra algunos re-arreglos de ADN. Factores externos: agentes alquilantes, medicamentos, radiaciones ionizantes y substancias químicas. Factores internos: Anormalidades cromosómicas que dan lugar a cambios en el ADN.

LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA Proliferación excesiva de una población celular desdiferenciada de estirpe mieloide. Se visualizan con cromatina laxa y nucléolo visible en un frotis de sangre periférica. Infiltran la médula ósea y, otros tejidos extramedulares (hígado, el bazo, la piel o el sistema nervioso,…), desplazando a la hematopoyesis normal Consecuencias clínicas de tipo anémico, infeccioso y hemorrágico Presentación en edades tardías (>50 años) Incidencia se sitúa en 1-2 casos por cada habitantes Se clasifican en subgrupos morfológicos que van desde la no diferenciada o M0 a la M7 o megacariocítica. El 50% con cariotipo normal. Necesarios marcadores moleculares específicos que contribuyan a subestratificar a los pacientes en nuevos grupos de riesgo.

GEN FLT3 (FMS-Tyrosine Kinase 3) LOCALIZACIÓN Cromosoma 13 (13q12) PROTEÍNA CODIFICADA Codifica para un receptor de tirosín-quinasa que regula la hematopoyesis ACCIONES PROTEÍNA Se activa mediante la unión de un ligando en el dominio extracelular: Homodimerización del receptor, provocando su autofosforilación. Activación proteínas implicadas en cascadas de señalización celular: Apoptosis Proliferación celular Diferenciación de las células hematopoyéticas en la médula ósea FRECUENCIA MUTACION LMA 25% MUTACIONES Duplicaciones internas en tándem (exón 14 del gen (Gln569-Gly613)) Mutación puntual en el ácido aspártico 835. CONSECUENCIAS 1.-Secuencia insertada entre los aminoácidos 575 y 613 que induce la activación constitucional de la proteína 2.-Activando la cascada de señales asociada a ella DETECCION PCR de los exones 14 y 15 del gen FLT3 UTILIDAD Midostaurin bloquea la FLT3 y otras proteínas en las células cancerosas que pueden contribuir al crecimiento celular Fotografía del programa GeneMapper (Thermo Fisher) de una muestra positiva con duplicaciones en tándem (parte superior) y otra negativa (parte inferior)

Fotografía del programa GeneMapper (Thermo Fisher) de una muestra positiva con duplicaciones en tándem (parte superior) y otra negativa (parte inferior)

GEN NPM1 (Nucleofosmina-1 o fosfoproteína nucleolar B23) LOCALIZACIÓN Cromosoma 5 PROTEÍNA CODIFICADA Fosfoproteína nucleolar de 294 aminoácidos ACCIONES PROTEÍNA Interviene en la duplicación del centrosoma durante la cariocinesis Como chaperona, en el plegamiento de las proteínas recién sintetizadas. Actúa de lanzadera entre el nucleolo, el núcleo y el citoplasma. Protege al supresor tumoral ARF en el nucleolo, impidiendo su degradación. FRECUENCIA MUTACION LMA 30% MUTACIONES Inserciones de 4 bases en heterocigosis en el codón 288 del exón 12 80% tipo A (c.863_864insTCTG) 11% tipo B (c.863_864insCATG) 8% tipo D(c.863_864insCCTG) CONSECUENCIAS Cambio de pauta de lectura en el extremo C-terminal de la proteína: Reemplazo de los 7 últimos aminoácidos de la proteína Cambio en la localización habitual de la proteína, del nucleolo al citosol Se impide unirse a otras proteínas y llevar a cabo su transporte normal DETECCION Amplificación mediante PCR de la zona de inserción del exón 12 El producto de PCR tiene un tamaño de: 198 pb si no hay mutación, 202 pb si hay mutación. UTILIDAD Marcador pronostico favorable

LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA La leucemia promielocítica aguda (LPA) es un subtipo de LMA definida por una única característica genética, la translocación aberrante (15;17)(q22;q12-21) que origina el gen de fusión PML-RARA. Las células que contienen este reordenamiento anómalo tienen bloqueado el proceso de diferenciación, quedando la médula ósea infiltrada de promielocitos anormales. Esta translocación es un rasgo específico y selectivo de las LPA del tipo M3 según la clasificación de la FAB (French-American-British).

GEN PML y RARA Translocación aberrante t(15;17)(q22;q12-21) LOCALIZACIÓN Cromosomas 15 y 17 PROTEÍNA CODIFICADA El gen PML codifica para una proteína oncosupresora El gen RARA codifica para un receptor nuclear ACCIONES PROTEÍNA PML interviene en el ensamblaje de los cuerpos nucleares encargados de activar procesos como la apoptosis, estabilidad genómica o control de la división celular RARA heterodimeriza con RXR. En ausencia de ligando se encuentran unidos al ADN, inhibiendo la transcripción de multitud de proteínas. FRECUENCIA MUTACION LMA 15% (es patognomónico de las LPA) MUTACIONES Se origina el gen de fusión PML-RARA. RARA el punto de ruptura tiene lugar siempre en el intrón 2 PML pueden originarse tres puntos ruptura: el 45% bcr1 (intrón 6), bcr3 (intrón 3) y del 5-10% bcr2 (exón 6) CONSECUENCIAS Bloqueo del proceso de diferenciación, infiltrando la MO de promielocitos anormales. DETECCION La técnica para la detección de los reordenamientos se basa en una PCR a tiempo real con sondas TaqMan®. Amplificación de tres productos de PCR distintos: el gen control (ABL1), el reordenamiento PML-RARA con el punto de ruptura en el intrón 6 (bcr1) o exón 6 (bcr2) y un tercero para la detección del punto de corte en el intrón 3 (bcr3). UTILIDAD Existen dos tipos de terapias dirigida para los pacientes con LPA y reordenamiento positivo: El ácido Trans-retinoico y el As2O3. En algunos casos la terapia es conjunta. Ambos fármacos interaccionan de manera eficiente con la proteína quimérica PML-RARA Trioxido de arsenico

NEOPLASIAS MIELOPROLFERATIVAS La célula madre pluripotente sufre una transformación maligna y origina una proliferación descontrolada de leucocitos, hematíes y/o plaquetas. Se distinguen 4 entidades distintas: Policitemia Vera LMC Mielofibrosis primaria Trombocitemia esencial

LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA Proliferación descontrolada de granulocitos en estado inmaduro Cursa con esplenomegalia, trombocitosis y anemia. 95% de los casos se produce una translocación recíproca t(9;22)(q34;q11) entre el cromosoma 9 y el cromosoma 22 (cromosoma Philadelphia) Sangre periférica: Aumento absoluto de granulocitos maduros (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) Existencia de granulocitos inmaduros Blastosis mínima Se observan todos los estadios madurativos intermedios

GEN Translocación recíproca t(9;22)(q34;q11) entre el cromosoma 9 y el cromosoma 22 (cromosoma Philadelphia) LOCALIZACIÓN Cromosomas 9 y 22 PROTEÍNA CODIFICADA BCR codifica por una proteína con actividad GTPasa ABL1 es una quinasa protooncogénica ACCIONES PROTEÍNA BCR función exacta se desconoce. ABL1 implicada en diferenciación, división, adhesión celular y respuesta al estrés FRECUENCIA MUTACION 95% LMC MUTACIONES Formación del oncogén BCR-ABL1. CONSECUENCIAS La proteína quimérica DR 210 Kd formada BCR-ABL1: Actividad tirosín-quinasa de forma constitutiva Inhibición de la reparación del genoma, provocando su inestabilidad DETECCION La PCR a tiempo real con el empleo de sondas TaqMan UTILIDAD Tratamiento: Imatinib es un inhibidor de tirosín-quinasa (ITQ) que actúa contra la proteína generada en el reordenamiento BCR-ABL1

En el paciente tratado con un ITK, se definen tres tipos de respuestas: 1.Respuesta hematológica: • Recuento de leucocitos < 10x109 /L. • Basófilos < 5%. • Ausencia de mielocitos, promielocitos y mieloblastos en el recuento leucocitario. • Recuento de plaquetas < a 450x109 /L. • Bazo no palpable. 2.Respuesta citogenética: • Sin respuesta citogenética: metafases Ph+ > 95%. • Mínima (RCmin): metafases Ph %. • Menor (RCm): metafases Ph %. • Parcial (RCP): metafases Ph+ 1-35%. • Completa (RCC): metafases Ph+ 0%.

3.Respuesta molecular: Para la cuantificación se emplean curva patrón para BCR-ABL1 y otra para ABL1 Se alcanzará la respuesta cuando los niveles de BCR-ABL1 son menores a los indicados o cuando no se detecta y el número de copias de ABL1 son iguales o mayores a los indicados.

En situación de alarma hay que aumentar la vigilancia y monitorizar con mayor frecuencia y ante una situación de fallo hay que cambiar a un ITQ de segunda generación, como nilotinib o dasatinib.

Resistencias moleculares: La resistencia a los diferentes ITQ por mutaciones en BCR-ABL1: Hasta 100 mutaciones en el dominio quinasa de BCR-ABL1 aunque 7 de ellas suponen el 85% de los casos resistentes. La mutación más frecuente es la p.Thr315Ile, donde el aminoácido treonina se encuentra unido al ITQ imatinib en caso de la proteína no mutada. Secuenciación Sanger : Gold standard para la determinación de mutaciones Sensibilidad baja (no se detecta por debajo de 15-20% de alelo mutado). Secuenciación masiva: Aumento sensibilidad en la detección de variantes (sobre 1% de frecuencia alélica)

OTRAS NEOPLASIAS MIELOPROLFERATIVAS Policitemia vera se caracterizada por un incremento en la producción de glóbulos rojos en médula ósea independiente de los mecanismos que normalmente regulan la eritropoyesis. La trombocitemia esencial cursa con una proliferación de la línea megacariocítica en médula ósea, con el posterior aumento de plaquetas en sangre periférica Mielofibrosis primaria se caracterizada por una proliferación de megacariocitos de morfología atípica en médula ósea, destacando la producción de depósitos de tejido conectivo fibroso, dando lugar a una hematopoyesis extramedular.

GEN JAK2 LOCALIZACIÓN Exón 14 cromosoma PROTEÍNA CODIFICADA JAK2 es una quinasa en la ruta JAK-STAT ACCIONES PROTEÍNA Se activa con la unión receptor-ligando para las citoquinas EPO, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) o la trombopoyetina (TPO). FRECUENCIA MUTACION El 90-95% de los pacientes con PV, pero también en el 60% de los pacientes con TE y MFP MUTACIONES Mutación c.1849G>T; p.Val617Phe en el exón 14 Mutaciones en el exón 12 en casos de PV y eritrocitosis idiopáticas CONSECUENCIAS Activación constitutiva de la proteína JAK2 en ausencia de la unión del ligando al receptor hematopoyético, provocando una activación permanente de esta vía de transducción de señales. DETECCION Para la determinación cuantitativa de la mutación p.Val617Phe en JAK2 se emplea la técnica de PCR a tiempo real alelo-específica con sondas para los alelos mutado y silvestre, donde se cuantifica la presencia de la mutación obteniendo un resultado de porcentaje de frecuencia alélica a partir del número de copias mutadas y no mutadas UTILIDAD Confirmar el diagnóstico

GEN CALRETICULINA LOCALIZACIÓN Brazo corto cromosoma 19 (19p 13.3-p13.2) PROTEÍNA CODIFICADA Calreticulina ACCIONES PROTEÍNA Localizada en retículo endoplasmático. Controla el plegamiento de proteínas y el mantenimiento de la concentración de Ca, ejerciendo un control de la actividad de los genes, la proliferación y migración de las células, la adhesión y la apoptosis. FRECUENCIA MUTACION 50-70% de pacientes con Trombocitemia esencial o Mielofibrosis primaria con JAK2 negativo MUTACIONES Inserción de 5 pb o delección de 53 pb al final del exón 9 CONSECUENCIAS Hay una desregulación de la proliferación y migración celulares. DETECCION Mediante PCR y análisis de fragmentos mediante electroforesis capilar. UTILIDAD Confirmar el diagnóstico

GEN MPL LOCALIZACIÓN Brazo corto del cromosoma 1 (1p34) PROTEÍNA CODIFICADA Receptor de la trombopoyetina ACCIONES PROTEÍNA Promueve el crecimiento y proliferación de las células, especialmente los megacariocitos. FRECUENCIA MUTACION 5% de la Mielofibrosis primaria y 1% de trombocitemia esencial MUTACIONES Mutaciones en el codón 515 (Trp515Lys o Trp515Leu) CONSECUENCIAS Sobreproducción de megacariocitos anormales DETECCION Mediante PCR y análisis de fragmentos mediante electroforesis capilar. UTILIDAD Confirmar el diagnóstico

Determinación de JAK2V617F Todos los casos con sospecha de NMP. El ensayo utilizado para detectar la mutación tenga una sensibilidad del 1-3%. Un resultado positivo confirma el diagnóstico de NMP. No informa del subtipo. Un resultado negativo no excluye el diagnóstico de una NMP. Estudio de mutaciones exón 12 JAK2 Sólo en los casos JAK2V617F negativos con sospecha clínica de PV. Estudio de mutaciones exón 9 CALR Sólo en los casos JAK2V617F negativos con sospecha de MFP o TE. Estudio de mutaciones exón 10 MPL Sólo en los casos JAK2V617F negativos y CALR negativos con sospecha de MFP o TE. Nuevos genes (TET2, ASXL1, EZH2, SRSF2, SF3B1,etc) Su papel diagnóstico/pronóstico está por determinar. No indicado por el momento en el diagnóstico de rutina.

LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA DE LINEA B La LLA-B representa el 75% de la LLA en adultos y el 85% de casos en niños. En el 80% de los casos se encuentran alteraciones genéticas numéricas y/o estructurales. Estas alteraciones definen los distintos subtipos de LLA-B, con características clínicas y biológicas propias.

GEN Reordenamiento t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1 (LLA-Ph+). LOCALIZACIÓN Cromosomas 9 y 22 PROTEÍNA CODIFICADA BCR codifica por una proteína con actividad GTPasa ABL1 es una quinasa protooncogénica ACCIONES PROTEÍNA BCR función exacta se desconoce. ABL1 implicada en diferenciación, división y adhesión celular y respuesta al estrés origina el gen de fusión PML-RARA. FRECUENCIA MUTACION 25% de los casos en adultos 2-4% de los niños. MUTACIONES Formación del oncogén BCR-ABL1. La proteína quimérica DR 210 Kd formada BCR-ABL1: Actividad tirosín-quinasa de forma constitutiva Inhibición de la reparación del genoma, provocando su inestabilidad En niños proteína quimérica de 190 kDa que se produce de la unión entre el exón 1 de BCR y el exón 2 de ABL1. CONSECUENCIAS En ambos casos esta mutación tiene pronóstico de alto riesgo La proteína quimérica BCR-ABL1: DETECCION La PCR a tiempo real con el empleo de sondas TaqMan UTILIDAD Tratamiento: Imatinib es un inhibidor de tirosín-quinasa (ITQ) que actúa contra la proteína generada en el reordenamiento BCR-ABL1

GEN Reordenamientos del gen KMT2A (MLL) con AF4 LOCALIZACIÓN Cromosomas 4 y 11 PROTEÍNA CODIFICADA Zinc finger protein HRX ACCIONES PROTEÍNA La proteína codificada por KMT2A tiene como función la regulación positiva de la transcripción mediante la metilación de histonas El gen AF4 codifica por un factor de transcripción que está involucrado en la ontogenia de la línea linfoide. FRECUENCIA MUTACION Este subtipo de LLA-B es más frecuente en niños menores de 1 año y su incidencia baja en niños mayores de 1 año, sin embargo vuelve a incrementarse con la edad en el adulto MUTACIONES Se han descrito mas de 73 reordenamientos con 54 genes distintos La translocación más frecuente es la t(4;11) con AF4 (AFF1). El reordenamiento puede ocurrir en varios puntos de corte en zonas intrónicas entre los exones 8-12 en KMT2A y 3-7 en AF4 CONSECUENCIAS Desregulación de la ontogenia linfoide DETECCION La cuantificación del reordenamiento tiene lugar mediante PCR cuantitativa a tiempo real con sondas Taqman®. UTILIDAD Las LLA con KMT2A-AF4 tienen mal pronóstico y los niños menores de 6 meses con translocaciones de KMT2A tienen peor pronóstico.

GEN Reordenamiento t(12;21)(p13;q22); ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) LOCALIZACIÓN Cromosomas 12 y 21 PROTEÍNA CODIFICADA Ambos genes codifican por factores de transcripción nucleares fundamentales para el control de la hematopoyesis normal. ACCIONES PROTEÍNA Acciones fundamentales para el control de la hematopoyesis normal. FRECUENCIA MUTACION Es frecuente en LLA de niños, donde supone el 25% de los casos. MUTACIONES El reordenamiento tiene 2 puntos de corte principales: Intrón 5 del gen ETV6 y dos entre los intrones 1 y 2 de RUNX1 La translocación ETV6-RUNX1 se considera una lesión temprana en la leucemogénesis. Se ha demostrado la formación del gen quimérico antes del nacimiento, y el debut de la LLA posteriormente, tras adquirir una alteración genética secundaria CONSECUENCIAS Modificación de la diferenciación linfoide normal DETECCION Es una translocación crítica que se detecta mediante FISH en citogenética o por PCR cuantitativa en Biología Molecular TERAPIA/PRONOSTICO Aunque es considerado un factor genético de buena respuesta al tratamiento, su influencia en el pronóstico de la LLA es controvertido, porque parece contribuir a la ocurrencia de recaída tardía.

LEUCEMIA LINFATICA CRÓNICA La leucemia linfática crónica es una neoplasia de células B maduras y es la más común que afecta a adultos en Europa y EEUU. La mayoría de pacientes permanecen asintomáticos en el momento del diagnóstico. El diagnóstico suele darse a partir del análisis de una hematimetría rutinaria. El curso clínico de la enfermedad es muy variable: Formas indolentes, que no requieren tratamiento Formas agresivas en pacientes cuya supervivencia expira en unos pocos años

GENES A ESTUDIO Genes IGHV (immunoglobulin heavy chain variable region), LOCALIZACIÓN Brazo largo cromosoma 14 (14q32.339 PROTEÍNA CODIFICADA Proteína región variable de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas ACCIONES PROTEÍNA Formación de inmunoglobulinas proporcionando la base para la estructura del receptor de reconocimiento de antígenos en células B FRECUENCIA MUTACION 60% MUTACIONES El porcentaje de homología con la secuencia de línea germinal IGHV se calcula teniendo en cuenta el número de diferencias entre el extremo 5’ de CDR1 (regiones determinantes de complementariedad ) y el extremo 3’ de FR3 (región marco). Se consideran secuencias como “mutadas” si el porcentaje de diferencias respecto a la secuencia de IGHV línea germinal difiere en más del 2%. CONSECUENCIAS El curso de la enfermedad en los pacientes con el gen IGHV mutado es mucho más indolente que en aquellos pacientes que tienen los genes IGHV no mutados, en los que es más frecuente presentar una enfermedad avanzada, con mayor número de alteraciones citogenéticas, con evolución clonal y resistencia a la quimioterapia. DETECCION Se amplifican los fragmentos correspondientes a los segmentos IGHV-D-JH con reordenamiento monoclonal realizando reacciones de PCR por separado con cada pareja de oligonucleótidos de los descritos en el protocolo de PCR múltiple recomendado por el consorcio BIOMED-2 (van Dongen et al. 2003). UTILIDAD Respuesta al tratamiento

GENES A ESTUDIO Gen TP53 LOCALIZACIÓN Brazo corto del cromosoma 17 (17pl3.1) PROTEÍNA CODIFICADA Proteína P53 ACCIONES PROTEÍNA Participa en diversas funciones fisiológicas de la célula para mantener la integridad y estabilidad genómica FRECUENCIA MUTACION 15% MUTACIONES Múltiples CONSECUENCIAS El ADN mutado de las células cancerígenas provoca mayor proliferación del cáncer y resistencia a los tratamientos con quimioterapia DETECCION Análisis de mutaciones en el gen TP53 por secuenciación Sanger o por NGS de manera individual o dentro de un panel de genes. UTILIDAD Respuesta al tratamiento

GAMMAPATIAS MONOCLONALES Enfermedades caracterizadas por una proliferación descontrolada de células plasmáticas que expresan en exceso un único tipo de cadena ligera y/o cadena pesada de las inmunoglobulinas. Se pueden distinguir 5 entidades distintas: Gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) Mieloma múltiple, Macroglobulinemia de Waldenström, Enfermedad de las cadenas pesadas Amiloidosis primaria. Excepto el GMSI suelen cursar con: Hipercalcemia ([Calcio total sérico] > 11.5 mg/dL), Insuficiencia renal ([Creatinina sérica] > 2 mg/dL), Anemia ([Hemoglobina] < 10 g/dL o dos g/dL por debajo de lo habitual) Enfermedad ósea (osteopenia grave).

GENES A ESTUDIO MYD88 LOCALIZACIÓN Brazo corto del cromosoma 3 (3p22) PROTEÍNA CODIFICADA Codifica una proteína que se une a la mayoría de receptores de tipo Toll ACCIONES PROTEÍNA Importantes en la respuesta inmune innata, con el objetivo de activar el factor de transcripción NF-КB., que regula la actividad de genes que controlan la respuesta inmunitaria FRECUENCIA MUTACION 90% para la Macroglobulinemia de Waldenström o linfoma linfoplasmocítico MUTACIONES Mutación p.Leu265Pro CONSECUENCIAS El factor NFkB nuclear anormalmente activo inhibe la apoptosis de células, contribuyendo a la acumulación de células linfoplasmocitarias. DETECCION Esta mutación se analiza mediante dos PCR alelo-específica a tiempo real con un cebador directo y dos cebadores reversos, uno mutado y otro salvaje UTILIDAD Ayuda al diagnóstico

LINFOMAS NO HODKIN Los linfomas No Hodgkin son enfermedades clonales de células B, T o NK en varios estadíos de diferenciación. Por lo general, comienza en los ganglios linfáticos u otro tejido, aunque pueden empezar en cualquier lugar del cuerpo donde se encuentra el tejido linfático: Ganglios linfáticos, Bazo, Médula ósea, Timo, Adenoides y amígdalas, Tracto digestivo, e incluso puede afectar a la piel Puede ser de crecimiento lento o de crecimiento rápido. Afecta con más frecuencia a los adultos, aunque los niños también pueden padecerlo. La edad, el sexo (mayor hombres) y un sistema inmunitario debilitado afectan el riesgo.

GENES A ESTUDIO Reordenamientos del gen de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas IGH con los genes BCL1 y BCL2, para el diagnóstico de linfoma de manto (30-40% de los casos) y linfoma folicular (60-70% de los casos), respectivamente. LOCALIZACIÓN BCL1 translocación t(11;14)(q13;q32) BCL2 translocación t(18;14) t(14;18)(q32;q21) PROTEÍNA CODIFICADA El gen BCL1 codifica para la ciclina D1 El gen BCL2 codifica proteínas de la familia de proteínas Bcl-2 ACCIONES PROTEÍNA El BCL1 es una Ciclina D1 específica para la transición entre las fases G1 y S del ciclo celular Proteínas BCL2 encargadas de la regulación de entrada en apoptosis celular (proteína antiapoptótica, es decir, su activación inhibe la apoptosis) FRECUENCIA MUTACION BCL1 65% BCL2 70% MUTACIONES Reordenamiento de IgH con BCL1 tiene lugar en una región de 85pb llamada MTC que se encuentra 360kpb antes del inicio del gen CCND1. Reordenamiento entre IgH y BCL2 tienen lugar en la región MBR de BCL2 dentro del exón 3. CONSECUENCIAS Expresión autonoma de BCL1 desregulando el paso de la fase G1 a S de los linfocitos Aumento expresión de BCL2 inhibiendo la apoptosis favoreciendo la inmortalidad celular DETECCION Los reordenamientos se analizan mediante PCR cuantitativa a tiempo real. UTILIDAD Diagnóstico

CONCLUSIONES La tendencia es el uso de paneles con los genes más relevantes en cada patología analizados mediante secuenciación masiva . El número de laboratorios de oncohematología en el que ya existen paneles de genes (patología linfoide o mieloide) va en aumento, con el objetivo del estudio completo de los exones de cada gen. La secuenciación masiva se va estableciendo en los laboratorios de biología molecular para poder informar a cada paciente cada una de las variantes encontradas con el objetivo de dirigir la diana terapéutica, en caso de que exista. El objetivo último es conseguir una medicina personalizada que facilite en gran medida la calidad de vida de los pacientes oncohematológicos.

PAPEL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL DIAGNÓSTICO HEMATOLÓGICO

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