Enzimas Curvas temporales de actividad enzimática de LDH

Presentación del tema: "Enzimas Curvas temporales de actividad enzimática de LDH"— Transcripción de la presentación:

1 Enzimas Curvas temporales de actividad enzimática de LDH

2 Proteínas

3 ¿Qué hacer en la práctica?
Cambiar el switch mental y enfocar los pensamientos en BIOQUÍMICA! Realizar curvas temporales (determinar actividad por espectrofotometría) de todas las fracciones ¡Mantener los tubos de extractos proteicos los tubos en hielo! Determinar la actividad de la LDH mediante curvas temporales (registrar velocidades inicales!!!)

4 LDH (EC ). Enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneración de ATP. El piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+

5 Actividad de Lactato deshidrogenasa

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7 Tomar lectura cada 10 segundos por 120 segundos

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11 U= µmol/min

12 Paso más eficiente de purificación
Paso más eficiente de purificación. En este ejemplo: Cromatografía de Afinidad

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16 Función de las proteínas
Centro de acción en procesos biológicos. Catalizan el conjunto de reacciones químicas a las que de manera general nos referimos como vida. Regulan: directamente como enzimas o indirectamente en forma de mensajeros químicos (hormonas, receptores, transportadores). Dan soporte: fibras musculares, micro fibrillas en ciclo celular, etc. En defensa: anticuerpos (inmunoglobulinas). Papel pasivo: colágeno en huesos, tendones, ligamentos.

17 Proteínas Estructural: relaciones en el espacio (3D) entre los componentes atómicos de una proteína: Estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Grupos prostéticos Modificaciones covalentes

18 Catalizador Molécula inorgánica u orgánica que incrementa importantemente la velocidad de una reacción química sin ser modificada o consumida en la reacción.

19 Enzimas Ej. Constante de equilibrio de una reacción: Keq = = = 100
Son catalizadores biológicos: disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, pero NO modifican la constante de equilibrio. Ej. Constante de equilibrio de una reacción: Keq = = = 100 Reacción catalizada por una enzima acelera la reacción 10,000 veces Keq = = = 100 K1 10 -3 K-1 10-5 K1 10 K-1 10-2

20 ¡CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA!
Ejemplo La reacción en que una molecula de orotidina monofosfato pierde un CO2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es catalizada por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa que cuando no es catalizada. 1017 = 100,000,000,000,000,000 ¡CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA!

21 Ventajas de enzimas sobre catalizadores inorgánicos
• EFICIENCIA Velocidades de reacción elevadas • CONDICIONES SUAVES DE REACCIÓN Temperatura, pH, presión • ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN Unión a sustrato • CAPACIDAD DE REGULACIÓN Control alostérico, modificación covalente, Síntesis-degradación

22 Sitio catalítico o sitio activo
Es una región tridimensional de la proteína que une específicamente al sustrato, mediante un reconocimiento estructural complementario. Contiene a los grupos catalíticos y los cofactores/coenzimas.

23 La catálisis enzimática requiere:
- Unión específica de la proteína al sustrato y a moléculas reguladoras. - Reactividad específica de la proteína con su sustrato.

24 Dos teorias para explicar la unión específica enzima-sustrato:
– TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA – TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO

25 TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA
E. Fisher, 1894 Estampado molecular La enzima tiene un sitio (sitio activo) en el que “encaja” perfectamente el sustrato, al unirse ambos se lleva a cabo la catálisis

26 TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO
D. Koshland, 1958 La unión del sustrato al sitio activo de la enzima promueve un cambio conformacional de la enzima para que al unirse ambos se lleve a cabo la catálisis

27 CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
En general, los nombres de las enzimas se forman añadiendo el sufijo “asa” al nombre de la sustancia en la que actúan

28 Enzyme Commission Number

29 En algunas reacciones enzimáticas es necesaria la presencia de cofactores o coenzimas para llevar a cabo la catálisis. Iones metálicos como Fe2+, Zn2+, Mg2+ Coenzimas Moléculas orgánicas Flavin mononucleótido o FMN Flavin adenin dinucleótido o FAD+, Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD+ Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP+ Grupo prostético Asociado de modo permanente a la enzima. Sitio activo de la enolasa que utiliza Mg 2+ como cofactor

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31 Las enzimas disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan

32 Cinética enzimática Es el estudio de la velocidad a la cual se lleva a cabo una reacción catalizada por una enzima y de los factores que la afectan.

33 Actividad enzimática = Velocidad
Velocidad = Actividad enzimática: la cantidad de sustrato desaparecido o producto formado por unidad de tiempo. Por tanto sus unidades son cantidad de producto o sustrato sobre unidad de tiempo Hora Minuto Segundo moles µmoles nmoles gramos miligramos µgramos

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35 Progreso de la reacción enzimática
Estado estacionario Es aquel en que la concentración del complejo ES permanece constante Fase de pre estado estacionario (mseg)

36 El patrón hiperbólico de velocidad de una enzima vs la concentración de sustrato se describe en el modelo de Michaelis-Menten

37 Condiciones en las que aplica la ecuación de Michaelis-Menten
Velocidad inicial [producto] en medio de ensayo al mínimo [sustrato] muy superiores a la concentración de la enzima La concentración de sustrato debe permanecer “casi” constante durante el periodo de tiempo en que se mide la reacción

38 Velocidad inicial • La velocidad de una rxn (no orden cero) disminuye a medida que ésta progresa ya que la concentración del reactante(s) disminuye, y porque si la reacción es reversible inicia la reacción inversa. • Por se mide la velocidad inicial (v0) de la rxn: la velocidad antes de que la concentración de los reactantes disminuya significativamente y que los productos alcancen una concentración que produzca una reacción inversa significativa. • En las reacciones catalizadas por enzimas, dos razones que hacen conveniente medir velocidades iniciales: el producto puede ser un inhibidor de la reacción, aún cuando la reacción no sea reversible. 2) la enzima puede ser inestable en el medio de reacción.

39 Parámetros cinéticos Velocidad máxima

40 Constante de Michaelis-Menten (Km)
La Km es la conc. de sustrato a la cual la velocudad es = Vmax/2 Es un parámetro de afinidad de la enzima por el sustrato Km ↑= baja unión al sustrato, baja afinidad por el sustrato Km ↓= alta unión al sustrato, alta afinidad por el sustrato

41 Factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas
Concentración de sustrato / cofactores Concentración de enzima Inhibidores Activadores pH Temperatura Sales

42 Actividad específica La actividad específica es la velocidad de una reacción enzimática expresada en términos de la cantidad de enzima como proteína.

43 Diseño de un ensayo enzimático
Para el diseño de un ensayo enzimático se requiere conocer la reacción que se analiza: Cuáles son las especies que se requieren: sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros. B) La estequiometría de la reacción C) Los efectos de pH, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad de la enzima.

44 Monitoreo de actividad enzimática
Espectrofotometría HPLC

45 Monitoreo de actividad enzimática
Radioensayos TLC

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