Moler tejido en nitrógeno líquido. Buffer NTES ( NaCl, Tris-HCl, EDTA, SDS) Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (50:49:1) (vortex y centrifugar). Fenol:Cloroformo:Alcohol.

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1 Moler tejido en nitrógeno líquido. Buffer NTES ( NaCl, Tris-HCl, EDTA, SDS) Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (50:49:1) (vortex y centrifugar). Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (vortex y centrifugar). 1/10 (v/v) Acetato de sodio e Isopropanol frío (Incubar a -20°C) (centrifugar). Etanol frío al 70% (vortex y centrifugar ) Agua con DEPC (vortex y centrifugar ) Precipitar con cloruro de Litio (Incubar a -20°C) (centrifugar). 1 2 3 4 Etanol frío al 70% (vortex y centrifugar ) Agua con DEPC (vortex y centrifugar ) 5 1/10 (v/v) Acetato de sodio e Isopropanol frío (Incubar a -20°C) (centrifugar). Agua libre de RNAsas 6 7 8 9 10 11 Extracción de RNA Método del Cloruro de Litio Destruir membranas celulares para que ácidos nucleicos estén disponibles. Lisis (desestibilizar estructuras) NaCl: forma capa iónica alrededor de ácidos nucleicos, previene contaminación con polisacáridos. Tris-HCl: mantiene pH de la solución estable EDTA: agente quelante, elimina cationes de la solución desestabiliza membranas e inhibe RNAsas SDS: solubiliza membranas, proteinas y lipidos Lisis (desestibilizar estructuras) NaCl: forma capa iónica alrededor de ácidos nucleicos, previene contaminación con polisacáridos. Tris-HCl: mantiene pH de la solución estable EDTA: agente quelante, elimina cationes de la solución desestabiliza membranas e inhibe RNAsas SDS: solubiliza membranas, proteinas y lipidos Eliminación de proteinas Fenol:cloroformo:alcohol isoamilico: acidos nucleicos (muy polar) permanecen en fase acuosa debido a su carga negativa, mientras que las proteinas (polares y no polares) quedan en la interfase y fase organica. Eliminación de proteinas Fenol:cloroformo:alcohol isoamilico: acidos nucleicos (muy polar) permanecen en fase acuosa debido a su carga negativa, mientras que las proteinas (polares y no polares) quedan en la interfase y fase organica. Precipitación Acetato de sodio: los acidos nucleicos cargados negativamente obtienen capa ionica positiva que facilita la presipitación. Isopropanol: elimina concentraciones residuales de sales y sustrae las moleculas de agua del acido nucleico promoviendo su precipitación. Precipitación Acetato de sodio: los acidos nucleicos cargados negativamente obtienen capa ionica positiva que facilita la presipitación. Isopropanol: elimina concentraciones residuales de sales y sustrae las moleculas de agua del acido nucleico promoviendo su precipitación. Rehidratar RNA con agua libre de RNAsas Con una electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra ya que mostrara claramente los diferentes tipos de RNAs Rehidratar RNA con agua libre de RNAsas Con una electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra ya que mostrara claramente los diferentes tipos de RNAs Precipitación diferencial con LiCl: Precipita eficientemente el RNA y no al DNA o proteínas. Precipitación Acetato de sodio: los acidos nucleicos cargados negativamente obtienen capa ionica positiva que facilita la presipitación. Isopropanol: elimina concentraciones residuales de sales y sustrae las moleculas de agua del acido nucleico promoviendo su precipitación. Precipitación Acetato de sodio: los acidos nucleicos cargados negativamente obtienen capa ionica positiva que facilita la presipitación. Isopropanol: elimina concentraciones residuales de sales y sustrae las moleculas de agua del acido nucleico promoviendo su precipitación.

2 Extracción de RNA Método del Cloruro de Litio Paso 1Destruir membranas celulares para que ácidos nucleicos estén disponibles 2Lisis (desestibilizar estructuras) NaCl: forma capa iónica alrededor de ácidos nucleicos Tris-HCl: mantiene pH de la solución estable EDTA: agente quelante, elimina cationes de la solución desestabiliza membranas e inhibe RNAsas SDS: elimina membranas y lipidos. Eliminación de proteinas Fenol:cloroformo:alcohol isoamilico: acidos nucleicos (muy polar) permanecen en fase acuosa debido a su carga negativa, mientras que las proteinas (polares y no polares) quedan en la interfase y fase organica. 3Eliminación de proteinas Fenol:cloroformo:alcohol isoamilico: acidos nucleicos (muy polar) permanecen en fase acuosa debido a su carga negativa, mientras que las proteinas (polares y no polares) quedan en la interfase y fase organica. 4Precipitación Acetato de sodio: los acidos nucleicos cargados negativamente obtienen capa ionica positiva que facilita la presipitación. Isopropanol: elimina concentraciones residuales de sales y sustrae las moleculas de agua del acido nucleico promoviendo su precipitación. 5Etanol al 70%: elimina todas las sales en la solución 6Rehidratar ácidos nucleicos 7Precipitación diferencial con LiCl: precipita eficientemente el RNA y no el DNA o proteínas. 8Etanol al 70%: elimina todas las sales en la solución 9Rehidratar RNA 10Precipitación Acetato de sodio: el RNA cargado negativamente obtienen capa ionica positiva que facilita la presipitación. Isopropanol: elimina concentraciones residuales de sales y sustrae las moleculas de agua del RNA promoviendo su precipitación. 11Rehidratar RNA con agua libre de RNAsas Con una electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra ya que mostrara claramente los diferentes tipos de RNAs