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TEMA 14: INFORMACIÓN GENÉTICA
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1. ADN COMO MATERIAL GENÉTICO
EXPERIMENTO DE GRIFFITH Trabajó con dos cepas de bacterias de Streptococcus pneumoniae, causante de la neumonía. Bacterias de la cepa S que contenían cápsula protectora y la cepa R sin cápsula protectora. 1) Inyectó a ratones bacterias de la cepa S(virulentas) y estos morían a los pocos días. 2) Inyectó a ratones bacterias de la cepa R(no virulentas) y estos permanecían sanos. 3) Inyectó a ratones bacterias de la cepa S muertas por calor y los ratones permanecían vivos. 4) Inyecto a ratones bacterias de la cepa S muertas por calor y bacterias de la cepa R vivas. Los ratones enfermaban y además en la sangre de los ratones aparecían bacterias de la cepa S vivas. Dedujo que las bacterias de la cepa S virulentas y muertas transmitían un factor transformante a las bacterias de la cepa R y las convertía en patógenas
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EXPERIMENTO DE AVERY En 1944 demostraron que el principio transformante era el ADN. Cultivaron bacterias en un tubo de ensayo , y fueron destruyendo uno por uno los componentes de la bacteria S para evitar la transformación. Destruyeron los polisacáridos de la cápsula pero aun así seguía produciéndose la transformación. Lo mismo ocurrió al destruir las proteínas, el ARN y los lípidos. Sólo cuando se destruía el ADN no se producía transformación. Luego, el ADN es el principio transformante que poseen las bacterias para transformar las R no virulentas en S virulentas
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EXPERIMENTO HERSHEY Y CHASE
En 1952 trabajaron con el virus bacteriófago T2 que ataca a la bacteria E.coli. El virus sólo tiene ADN y proteínas marcaron ambos. S para proteínas y P para el ADN. Vieron cual entraba en las bacterias. Es el ADN el que entra en la bacteria y se integra al cromosoma bacteriano.
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2.MODELO REPLICACIÓN DEL ADN
La replicación ( = duplicación) del ADN ocurre en la fase S de la interfase en células eucariontes. Watson y Crick ya intuyeron como se producía al plantear su modelo de doble hélice. Pero surgen 3 posibles modelos. HIPÓTESIS CONSERVATIVA. Las dos hebras de ADN se separan y sirve cada una de molde para sintetizar una nueva hebra. Posteriormente las dos hebras antiguas se vuelven a unir y también lo hacen la hebras nuevas. El ADN resultante es una molécula formada por ADN antiguos y otra por ADN nuevos. HIPÓTESIS SEMICONSERVATIVA. Las dos hebras de ADN se separan y cada una hace de molde para una nueva hebra. El ADN resultante posee una hebra antigua y una hebra nueva. HIPÓTESIS DISPERSIVO Las dos hebras se separan y sirven de molde para formar fragmentos de ADN nuevos. Posteriormente las fragmentos se unen para dar los nuevos ADN. Estos contienen fragmentos de ADN antiguos y fragmentos de ADN nuevos
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EXPERIMENTO DE MESSELSON Y STAHL
Realizaron un experimento para comprobar la hipótesis replicativa correcta. Utilizaron la técnica de centrifugación en gradiente de densidad. Una vez centrifugadas, las moléculas más pesadas quedan más cerca del fondo del tubo de ensayo y las más ligeras más lejos. Utilizaron dos isótopos de nitrógeno el N14(ligero), N15(pesado) Cultivaron bacterias E.coli en un medio con N15 durante un tiempo para que las bacterias incorporasen el isótopo. y después las pasaron a uno de N14 y compararon las densidades del ADN de los diferentes ciclos de división.
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- En la 1ª generación el ADN tenía densidades intermedias entre el ADN pesado y ligero. Descartaron la hipótesis conservativa, ya que según esta deberían haber aparecido dos bandas, una correspondiente al ADN ligero y otra al pesado. - En la 2ª generación aparecen una banda correspondiente a ADN ligero y otra a ADN intermedio. Descartaron la hipótesis dispersa , ya que según esta los ADN aparecidos deberían ser todos intermedios - En la 3ª generación aparecen bandas correspondiente a ADN ligero y otras intermedia.. Estos resultados apoyan la hipótesis semiconservativa.
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3. CARACTERÍSTICAS DE REPLICACIÓN.
Es semiconservativa: Cada molécula de ADN está formada por una hebra antigua y otra nueva. Se realiza por adición de nucleótidos en sentido 5´ ´ Es bidireccional: A Partir de un punto de replicación avanza en los dos sentidos. En virus y bacterias hay un único punto de inicio, pero en eucariontes existen mas puntos de inicio de los que se forman fragmentos de ADN. Cada fragmento de ADN que se replica a partir de un único origen se le llama replicón. Es semidiscontinua. La hebra de ADN 3´- 5´,llamada hebra conductora se copia de forma continua. La otra hebra 5´- 3´, llamada hebra retardada se copia a base de fragmentos que luego se sueldan, llamados fragmentos de okazaki. Se necesita para iniciar la replicación un fragmento de ARN primer o cebador, que posteriormente se elimina.
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4. ENZIMAS DE LA REPLICACIÓN
ADN POLIMERASA Esta enzima forma el enlace fosfodiester y une nucleótidos. Necesita una hebra de ADN molde. Sólo sabe leer en sentido 3´- 5´ y une los nucleótidos en sentido 5´- 3´ Necesita para empezar que previamente se forme un fragmento de ARN de unos 10 nucleótidos, llamado primer o cebador, que es sintetizado por la ARN polimerasa. En procariontes existe otra enzima, la ADN polimerasa I que separa el ARN cebador y lo sustituye por ADN y el papel corrector de errores lo realiza la ADN polimerasa II que repara roturas en la cadena de ADN y la ADN polimerasa III que forma la cadena nueva. En eucariontes existen 5 ADN polimerasas para repartirse las funciones. - Una se encarga de copiar la hebra conductora - Otra se encarga de la formación de los fragmentos de okazaki - Otra une los fragmentos - Otra duplica el ADN en mitocondrias y también tienen papel reparador.
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OTRAS ENZIMAS DE LA REPLICACIÓN
ARN POLIMERASA o PRIMASA: Forma el ARN primer. HELICASAS y TOPOISOMERASA: Rompen los puentes de hidrógeno entre las hebras de ADN y desenrolla las hélices. PROTEINAS SSB: Se unen a la cadena de ADN separada, para que no se enrolle antes de ser copiadas. NUCLEASAS. Rompen el ARN cebador y repara lesiones en el ADN. LIGASAS: Une los fragmentos de ADN
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5. REPLICACIÓN EN PROCARIONTES
FASE DE INICIACIÓN. En el cromosoma bacteriano, a replicación tiene un origen único. Existe un lugar de inicio de la replicación, que es una zona rica en una secuencia de bases determinada GATC llamada oriC o punto de iniciación, a la que se une una proteína específica que reconoce este punto. Las enzimas helicasas rompen los puentes de hidrógeno y separan las hebras. Al abrirse la doble hélice se producen tensiones en las zonas adyacentes que podrían llevar a un nuevo enrollamiento, y esto es vitado por las girasas y topoisomerasas que liberan las tensiones rompiendo momentaneamente e ADN y volviendo a soldarlo. La proteina SSB( Single Strand Binding DNA) se une a las hebras molde e impiden que se vuelvan a enrollar, pero dejando las bases accesibles para otras moléculas. Alrededor de OriC, se forma una burbuja de replicación y hay dos zonas con forma de Y que reciben el nombre de Horquillas de replicación.
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FASE DE ELONGACIÓN FASE DE TERMINACIÓN
Como las hebras son antiparalelas y la ADN polimerasa sólo sabe leer la información en sentido 3´- 5´, las dos hebras se copian de forma diferente. HEBRA CONDUCTORA o líder 3´- 5´ 1º) Se copia el ARN cebador o primer( unos 10 nucleótidos) por parte de la ARN polimerasa. ( El cebador es necesario para iniciar cualquier duplicación) 2º) La ADN polimerasa III sintetiza la cadena de ADN 3º) La ADN polimerasa I hace el papel de exonucleasa, suelta el ARN primer y completa el fragmento de ADN. ( si fuese necesario tb. Elimina nuleótidos mal apareados) HEBRA RETARDADA 5´- 3´ 1ª) Se forman pequeños fragmentos de okazaki en sentido 5´- 3´ . Cada uno contiene un fragmento de ARN primer y la ADN polimerasa sintetiza el fragmento de ADN. 2º) La ADN polimerasa I libera el ARN primer y lo sustituye por ADN. 3ª La ADN ligasa una los fragmentos de okazaki FASE DE TERMINACIÓN Se produce cuando se termina o cierra la horquilla de replicación
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CORRECCIÓN DE ERRORES La ADN polimerasa III tiene bastante rigor a la hora de elegir el nucleótido adecuado no obstante puede producir errores (uno por cada bases) La ADN polimerasa I tiende a eliminar cualquier nucleótido recien añadido, con su actividad exonucleasa. Si detecta que hay un nucleótido incorrecto, se detiene la unión del siguiente, libera el nucleótido erroneo y la ADNpolimerasa III lo reemplaza. También existe la posibilidad de que una vez copiada la cadena pueda repararse el fragmento incorrecto, pero este proceso es más complicado y no bien conocido. A pesar de esta capacidad autocorrectora algunos errores se mantienen y son los causantes de las mutaciones y tienen gran importancia en la evolución.
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6. DIFERENCIAS CON EUCARIONTES
En eucariontes el ADN está asociado a histonas, formando los nucleosomas, es necesario que la replicación esté asociado a la síntesis de histonas. Los nuevos nucleosomas se incorporan a la hebra retardada y los antiguos se quedan en la conductora. En eucariontes la cantidad de ADN es mucho mayor, si sólo se diese un lugar de inicio sería muy lenta, por tanto se dan muchas unidades de replicación ,llamadas replicones. Ej. Drosophyla melanogaster el cromosoma mas grande tiene 6000 horquillas de replicación y el proceso dura 3 min. El tamaño de los fragmentos de okazaki es diferente, es menor en eucariontes. En procariontes tiene una longitud de a nucleótidos y en eucariontes entre 150 y 200. En procariontes se realiza en el hialoplasma y en eucariontes en el núcleo. EL número de ADN polimerasas es diferente. En procariontes la ADN polimerasa que fabrica la dos hebras es la misma, en eucariontes es distinta. En células eucariontes no se puede completar la replicación de los telómeros, después de eliminar el ARN primer de la hebra retardada, la ADN polimerasa no puede rellenar el hueco ya que no puede sintetizar en sentido 3´- 5´. El telómero se va acortando en cada división y se asocia al envejecimiento y muerte celular. En células madre y cancerígenas existe activa la telomerasa que impide el acortamiento y por tanto también impide la muerte celular programada ( apoptosis)
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