ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETAÍNA ALDEHÍDO DESHIDROGENASA

Presentación del tema: "ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETAÍNA ALDEHÍDO DESHIDROGENASA"— Transcripción de la presentación:

1 ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETAÍNA ALDEHÍDO DESHIDROGENASA
DE ESPINACA González Segura, Lilian1*, Díaz Sánchez, Ángel G.1, Rudiño Piñera, Enrique2, Mújica Jiménez, Carlos1 , Montiel, Carmina1 y Muñoz Clares, Rosario A.1 1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F., 04510, México. y 2Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, UNAM, Cuernavaca, Mor, 62210, México. Correo electrónico: Sitio activo Introducción La posición del agua 2 (Wat2) es la que más se acerca a la trayectoria de Bürgi-Dunitz, que es la ideal para que un nucléofilo realice el ataque nucleofílico sobre el carbono de un carbonilo. Pero esta agua sólo puede estar presente cuando existe una Val en la posición equivalente a Trp456, como en la PaBADH. Si el residuo en esta posición es Phe, Trp o His la molécula de agua no puede colocarse en la posición de Wat2. El análisis de la estructura de la SpBADH nos llevó a proponer a Wat1 como un buen candidato para ser el agua hidrolítica, debido al gran volumen del Trp456 que es incompatible con Wat2. Glu257 Glu467 Trp456 Cys450 Cys291 Transferencia del hidruro Lys168 NAD+ Entrada del aldehído El paso final en la biosíntesis del osmoprotector glicina betaína en plantas superiores que se lleva a cabo en los cloroplastos es la oxidación irreversible de betaína aldehído a glicina betaína en la reacción catalizada por la betaína aldehído deshidrogenasa (BADH). NAD+ NADH H2O H+ Betaína aldehído Glicina betaína En plantas como espinaca que acumulan glicina betaína en respuesta al estrés osmótico producido por sequía, suelos salinos o bajas temperaturas, los niveles de RNAm, de proteína y de actividad de BADH se incrementan bajo este tipo de estrés (1). La BADH de espinaca (SpBADH) es un dímero con 497 residuos por subunidad. La SpBADH utiliza como coenzima al NAD+. El mecanismo químico de la reacción catalizada por las ALDHS involucra 3 pasos principalmente: 1) el ataque nucleofílico del tiol de la cisteína catalítica sobre el carbono del aldehído (acilación), el cual produce un intermediario tiohemiacetal; 2) la transferencia del hidruro del intermediario tiohemiacetal al anillo de piridina del NAD(P)+ que produce un intermediario tioéster y 3) el ataque nucleofílico de una molécula de agua sobre el tioéster (desacilación). El objetivo principal de este trabajo fue obtener la estructura tridimensional de la SpBADH con el fin de caracterizar estructuralmente a esta enzima y conocer más a fondo su mecanismo de reacción y regulación. Parámetros cinéticos y de unión al equilibrio del NAD(H) de la enzima silvestre y Trp456Val Figura 3. Acercamiento del sitio activo de la SpBADH mostrando los residuos catalíticos. silvestre mutante Vmax (U/mg P) 3.2 ± 0.2 13.1 ± 1.0 KA (μM) 11 ± 2.0 27.8 ± 2.0 KB (μM) 54 ± 3.0 132.1 ± 22.0 kcat/KA (s-1 M-1) 3.25x105 5.24x105 kcat/KAKB (s-1 M-2) 6.01x109 3.96x109 KdNADH (μM) 5.7 ± 0.3 8.0 ± 0.5 KdNAD+ (μM) 0.32 ± 0.03 0.930 ± 0.05 La cisteína catalítica, Cys291, está en la conformación de ataque, que es la posición adecuada para realizar el ataque nucleofílico sobre el aldehído. El anillo de nicotinamida del NAD+ se observó dentro del sitio activo en la posición de “transferencia del hidruro”. El glutámico catalítico, Glu257 que participa como una base general en la activación de una molécula de agua hidrolítica, se encontró en una conformación no observada en ningún otro cristal de una ALDH, interaccionando con el carbonilo del Trp456. Otro hallazgo novedoso en esta estructura es el puente de hidrógeno entre el oxígeno de la carboxiamida y el NE1 del Trp456. KA es la Km aparente para el NAD+, KB es la Km aparente para la betaína aldehído. La mutación Trp456Val produjo una enzima que tiene una afinidad menor por NAD(H), medida ésta tanto por estudios de velocidad inicial como por unión al equilibrio,y por el aldehído, medida por la Km. Ambos resultados son consecuencia de la pérdida de las interacciones que hace el Trp456. La mutante posee una kcat cuatro veces mayor que la enzima silvestre, lo que indica que el paso limitante de la reacción ha cambiado. Glu179 Arg40 NADP+ A Glu185 Ala41 NAD+ B Resultados y discusión Datos cristalográficos de la SpBADH con NAD+ Estadística de la colecta de datos y refinamiento Grupo espacial P1 Dimensiones de la celda a, b, c (Å) , β,  (grados) , 84.8, 77.9 Unidad asimétrica dos dímeros Intervalo de resolución (Å) Reflexiones únicas Integridad (%) (94.58) I/(I) (1.9) Rmerge (%) (38.5) Rwork (%) Rfree (%) Los datos entre paréntesis corresponden a la faja de alta resolución. La estructura presentada está en proceso de refinamiento. Unión al equilibrio del nucleótido en la SpBADH silvestre Unión al equilibrio del nucleótido en la SpBADH Trp456Val Cinética de saturación de la SpBADH silvestre y Trp456Val Figura 4. Sitio de unión del NAD(P)+. A. PaBADH. B. SpBADH. En el pánel A se muestra el puente salino del Glu179 con la Arg40 en la PaBADH, lo cual aleja al carboxilato del 2’ fosfato del NADP+ evitando la repulsión electrostática entre estos dos grupos (3). Mientras que en la SpBADH (pánel B) en la posición de la Arg40 se encuentra una Ala, lo cual no atrae ni estabiliza al Glu185 hacia la conformación observada en la PaBADH. Estructura tridimensional B dominio de unión a la coenzima dominio catalítico dominio de oligomerización A A Tyr154 Cys286 Trp161 Val453 Val285 Ser447 Betaína aldehído Trp456 Trp167 Cys450 Cys291 Tyr160 Ile290 B Efecto isotópico del D2O sobre la kcat de las enzimas silvestre y Trp456Val silvestre mutante H2O kcat (s-1) 3.78 14.33 D2O kcat (s-1) 2.47 7.44 H2O kcat (s-1) / D2O kcat (s-1) 1.53 1.92 Figura 5. Sitio de unión de betaína aldehído modelado por docking rígido. A. PaBADH. B. SpBADH. Figura 1. Estructura tridimensional de la SpBADH. A) Monómero. La cisteína catalítica (Cys291) se encuentra representada en esferas amarillas. B) Dímero. El Trp456 en la SpBADH estabiliza la conformación del Trp167, permitiendo que éste interaccione con el aldehído, a diferencia de la Val453 de la PaBADH que no fija al Trp161, por lo que éste no interacciona con el aldehído. La topología de la SpBADH es muy similar a la que se ha descrito para las ALDHS, sólo difiere en el dominio de oligomerización que tiene dos hebras, en lugar de tres que tienen las enzimas tetrámericas. Leu258 Glu257 Trp456 Cys291 Wat1 Wat2 SpBADH ALDH2 (1O01) PaBADH (2WME) ALDH3 (1AD3) BADH de bacalao (1A4S) SmGAPN (1EUH) BhALDH (3I44) TtGAPN (1UXU) 3.1 3.5 2.9 La mutante Trp456Val mostró un efecto isotópico del solvente sobre la kcat mayor que el de la enzima silvestre, indicando que el paso de hidrólisis del intermediario tioéster de la reacción es más limitante de la velocidad en la enzima mutante que en la silvestre. Los resultados anteriores sugieren que el Trp456 podría estar participando en la colocación de Wat1 y del nucleótido. Vistas laterales 180 Entrada del aldehído A B Entrada del nucleótido Referencias Entrada del nucleótido Weretilnyk, E. A. y Hanson, A. D. (1989) Arch Biochem Biophys, 271, Valenzuela-Soto, E. M. y Muñoz-Clares, R. A. (1993) J Biol Chem, 268, , and Additions and Corrections, J. Biol. Chem. 269, 4692. González-Segura, L., Rudiño-Pinera, E., Muñoz-Clares, R. A. and Horjales, E (2009) J. Mol. Biol. 385, Figura 2. Representación del dímero en superficie mostrando el potencial electrostático. Figura 6. Posiciones e interacciones de moléculas de agua ordenadas que han sido propuestas como hidrolíticas en diferentes ALDHS. En rojo se observan las cargas negativas, en azul las cargas positivas y en blanco las neutras. Figura 2A. Dímero con la misma orientación que en la Fig. 1B. La cavidad central de la intercara entre los monómeros y los dominios de oligomerización presentan un gran número de cargas positivas, mientras que la región de entrada del aldehído está rodeada de cargas negativas. Se han propuesto varias moléculas de agua ordenadas en el sitio activo de las ALDHS que pueden llevar a cabo la hidrólisis del intermediario tioéster. En la Fig. 6 se presentan dos de estas moléculas de agua. Sin embargo, en la SpBADH no se observa ninguna de estas dos moléculas de agua, ya que éstas son estéricamente incompatibles con el NAD+. Agradecimientos Trabajo financiado por DGAPA (IN204708) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (101986).