CLASE INTRODUCTORIA No. 2: “REPLICACIÓN DEL DNA”

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1 CLASE INTRODUCTORIA No. 2: “REPLICACIÓN DEL DNA”
GENÉTICA MOLECULAR Lic. Deborah E. Rodríguez

2 DNA  RNAm  PROTEÍNAS “Es la síntesis del DNA formándose 2 moléculas hijas idénticas a la molécula madre” 27/08/2008

3 JUSTO ANTES DE LA DIVISIÓN CELULAR. ¿DÓNDE SE LOCALIZA? EN EL NÚCLEO.
¿CUÁNDO OCURRE? JUSTO ANTES DE LA DIVISIÓN CELULAR. ¿DÓNDE SE LOCALIZA? EN EL NÚCLEO. 27/08/2008 Dra. Genoveva Martín MSc

4 REGLAS FUNDAMENTALES Es semi conservativa.
Empieza en un punto de origen. Ocurre bidireccionalmente. La dirección de lectura es 3’  5’ La dirección de síntesis es 5’  3’ y es semi discontinua. La polimerización es termodinámicamente favorable 27/08/2008

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6 REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS MODELOS O TEORÍAS
DISPERSIVA CONSERVATIVA SEMICONSERVATIVA

7 Las cadenas de DNA progenitoras se rompen a intervalos, y las dos moléculas de DNA de doble cadena resultantes (moléculas hijas) presentan fragmentos del DNA progenitor combinados con fragmentos nuevos.

8 Cada una de las hebras del DNA progenitor se duplica produciendo dos moléculas hijas una de las cuáles es la molécula de DNA progenitora intacta y la otra una molécula de DNA cuyas dos hebras son nuevas.

9 Se originan dos moléculas de DNA, cada una de ellas compuesta de una hebra del DNA original y de una hebra complementaria nueva. Propuesta por el modelo de Watson y Crick.

10 REQUERIMIENTOS DE LA REPLICACIÓN
MOLDE  Cadena de DNA dúplex. SUSTRATOS: 4 Ribonucleósidos Trifosfatados (ATP, GTP, UTP, CTP) 4 Desoxiribonucleósidos (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) Mg2++ ATP Proteínas Estabilizadoras de la Hebra Simple del DNA (SSB).

11 ENZIMAS PROTEÍNA DNA a HELICASAS TOPOISOMERASAS I Y II (DNA GIRASA)
PRIMASA O RNA POLIMERASA DNA POLIMERASAS: DNA POLIMERASA III DNA POLIMERASA I PIROFOSFATASAS DNA LIGASA

12 ENZIMAS DE LA REPLICACIÓN
Proteína DNA a  Separa las cadenas del DNA dúplex. DNA Helicasas  Desenrollan la doble hélice. Proteínas Estabilizadoras del DNA Monocatenario (SSB) Mantienen abierta la hélice. Topoisomerasas I y II  Estabilizan el desenrrollamiento.

13 ENZIMAS DE LA REPLICACIÓN
RNA Primasa  Genera el RNA cebador. RNA Cebador  Permite que empiece a actuar la DNA Pol III. DNA Polimerasas III  Sintetiza las cadenas de DNA. DNA Polimerasa III y I  Corrección de errores. Pirofosfatasas  Aportan la energía necesaria. DNA Ligasa  Une los fragmentos de Okazaki.

14 INICIACION 2. ELONGACION 3. TERMINACION
ETAPAS INICIACION 2. ELONGACION 3. TERMINACION

15 “Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c”
PRE-INICIACIÓN “Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c” LOCALIZAR ORIGEN DE REPLICACIÓN Ori C. SEPARAR LAS CADENAS. FORMACIÓN DEL TOPOISÓMERO (-). FORMACIÓN DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN. Enzimas Que Participan: Proteína dnaA DNA Helicasas Proteínas Estabilizadoras del DNA Monocatenario (SSB) DNA Topoisomerasas I y II Primosoma 27/08/2008

16 “Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c”
PRE-INICIACIÓN “Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c” 1- Proteína dnaA separa la molécula doble del DNA formando regiones de cadena simple. 2- DNA Helicasas facilitan el desenrrollamiento de la cadena dúplex. 3- Proteínas SSB se unen a las hebras molde para que no vuelvan a enrollarse. 4- DNA girasa y Topoisomerasas I y II eliminan la tensión generada por la torsión en el desenrrollamiento. 27/08/2008

17 PROTEÍNA dnaA  20 – 50 monómeros.
Se unen a secuencias especificas de nucleótidos en el origen de la replicación (rico en pares de bases de AT)  Ori C (245 pb). Requiere ATP. Separa la molécula doble del DNA formando regiones de cadena simple. La proteína dnaA se une al ori C y a ellos se unen las proteínas dnaB y dnaC, formando un complejo proteico.

18 PUNTO DE ORIGEN PROCARIOTAS  UNO EUCARIOTAS  MÚLTIPLES 27/08/2008

19 PROTEÍNAS ESTABILIZADORAS DE LA HEBRA
SIMPLE DEL DNA (SSB)  Se unen a la cadena simple cooperativamente, una favorece la unión de las demás. Mantienen el equilibrio entre la cadena simple y la doble del DNA. Mantienen separadas las cadenas y las protegen de las Nucleasas de DNA de cadena simple.

20 DNA HELICASAS  Se unen al DNA de cadena simple cerca de la horquilla y se mueve a la región de cadena doble forzando la separación y el desenrrollamiento del DNA. Requieren ATP. Cuando las cadenas se separan las SSB se unen evitando que se forme de nuevo la hélice.

21 TOPOISOMERASAS  Al separarse las cadenas del DNA doble se forman superenrollamientos positivos/ negativos en la región de la horquilla de replicación. Las Topoisomerasas se encargan de remover esos superenrollamientos.

22 Así, relaja los superenrollamientos acumulados.
I  Corta reversiblemente una sola cadena de la doble hélice, pasa la cadena intacta a través de la rotura y resella. Así, relaja los superenrollamientos acumulados. No requieren ATP. Tienen actividades de Nucleasa y de Ligasa. Negativos  E. coli Negativos y Positivos  Eucariotas

23 Tiene actividades de Nucleasa y de Ligasa.
II  DNA GIRASA Corta ambas cadenas de la doble hélice, pasa la cadena intacta a través de las roturas y resella. Así, introduce superenrollamientos negativos en el DNA. Requiere ATP. Tiene actividades de Nucleasa y de Ligasa. 27/08/2008

24 Agentes Anti cáncer: Etopósido Diana  Topoisomerasa II humana.
Agentes Antimicrobianos: Quinolonas Ciprofloxacina  Diana  DNA girasa bacteriana 27/08/2008

25 “Síntesis del RNA iniciador”
INICIACIÓN “Síntesis del RNA iniciador” FORMACIÓN DEL COMPLEJO INICIADOR. FORMACIÓN DEL RNA INICIADOR. UNIÓN DEL PRIMER DESOXIRRIBONUCLEÓTIDO. ENZIMAS QUE PARTICIPAN: Primosoma  Primasa (RNA Pol) + Complejo Proteínas dnaA, dnaB y dnaC. DNA Pol III 27/08/2008

26 “Síntesis del RNA iniciador”
INICIACIÓN “Síntesis del RNA iniciador” Primasa sintetiza la molécula de RNA cebador o Primer. DNA Pol III une el 1er. desoxirribonucleótido al extremo 3’ -OH del cebador. 27/08/2008

27 PRIMASA O RNA POLIMERASA 
Sintetiza de novo secuencias cortas de RNA (5 a 10 nucleótidos) de manera complementaria y antiparalela al molde de DNA. Secuencia de RNA cebador, necesaria para que actúe la DNA Pol III. No tiene actividad correctora. PRIMOSOMA  Es la unión de la Primasa con el complejo de proteínas (dnaA, dnaB y dnaC) que se unen al DNA simple.

28 DNA Polimerasa III sintetiza las nuevas
ELONGACIÓN “Síntesis del DNA” ALARGAMIENTO DE LAS CADENAS DE DNA. HEBRA CONDUCTORA Y HEBRA RETRASADA. PARTICIPAN DNA POL III , DNA POL I, PIROFOSFATASAS Y DNA LIGASA. DNA Polimerasa III sintetiza las nuevas hebras en sentido 5’3’. 27/08/2008

29 DNA POLIMERASA III (Mg2++)
Actividad de Polimerasa 5’  3’  Polimeriza nucleótidos en sentido 5’  3’ (1,000 n/seg.). La cadena matriz 5’  3’ del DNA para que sea copiada debe dar una vuelta “De trombón” para que la DNA Polimerasa pueda desplazarse por ella. Actividad de Exonucleasa 3’  5’  Hidroliza los nucleótidos, que no estén correctamente colocados, en sentido 3’  5’ y rellena. Esto asegura la fidelidad de la replicación.

30 ELONGACIÓN 27/08/2008

31 UNIÓN DE LOS NUCLEÓTIDOS
Los nucleótidos se unen entre sí mediante por enlaces fosfodiester acción de las enzimas Primasa (RNA Pol), DNA Pol I y III. Se unen enlazando el grupo P5’ de un nucleótido con la posición 3’ del siguiente. Cada nucleótido debe tener tres grupos P para poder ser incorporado a la cadena polinucleotídica.

32 El nucleótido pierde dos P como pirofosfato (PPi) y se une al azúcar del nucleótido siguiente a través del P restante. Las Pirofosfatasas rompen el enlace del pirofosfato para proporcionar energía a la reacción.

33 ELONGACIÓN La cadena 3’5’es leída por la DNA polimerasa III de manera continua precedida por RNA cebador (cadena conductora, va en dirección a la apertura de la horquilla). La cadena 5’3’ no puede ser leída directamente, esto se soluciona invirtiendo la cadena y leyéndola en pequeños fragmentos de DNA (Okazaki -1,000 n), precedidos por RNA cebador, que crecen en sentido 5’3’ y que más tarde se unen (cadena retrasada, va en dirección contraria a la apertura de la horquilla). 27/08/2008 Dra. Genoveva Martín MSc

34 DNA POLIMERASA I 1- Actividad de Exonucleasa 5’  3’
PARA ELIMINAR AL RNA INICIADOR. Separación de los ribonucleótidos del RNA Cebador y sustitución por los desoxirribonucleótidos correspondientes. 2- Actividad de Polimerasa 5’  3’ PARA SINTETIZAR DNA EN DIRECCIÓN 5’  3’ Rellena los huecos con DNA (10 n/seg.). 3- Actividad de Exonucleasa 3’  5’ PARA EFECTUAR LAS CORRECCIONES. Separación de desoxirribonucleótidos incorrectos y sustitución por los correctos.

35 DNA LIGASA Sella en forma covalente las brechas del DNA sintetizado por la DNA Pol III y el sintetizado por la DNA Pol I, o sea, une los fragmentos de OKAZAKI. Estos nucleótidos deben estar situados en una estructura de doble cadena y apareados de manera correcta. Requiere ATP  AMP + PPI o NAD+  AMP + NMP

36 AMBAS CADENAS

37 TERMINACIÓN “Corrección de Errores”
SE REALIZA LA LECTURA DE PRUEBA PARA CORREGIR POSIBLES ERRORES. SE CULMINA LA REPLICACIÓN Y LAS MOLÉCULAS HIJAS DEL DNA SE SEPARAN. REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA. Las enzimas correctoras son la DNA Pol III y la DNA Pol I que corrigen todos los errores cometidos en la replicación o duplicación. 27/08/2008

38 DNA POL III Y DNA POL I PARA EFECTUAR LAS CORRECCIONES.
Actividad de Exonucleasa 3’  5’  Hidroliza los nucleótidos, que no estén correctamente colocados, en sentido 3’  5’ y rellena. Esto asegura la fidelidad de la replicación.

39 INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN
27/08/2008 Dra. Genoveva Martín MSc

40 INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN
1- Bloquean la replicación del DNA al detener la elongación de la cadena, enlenteciendo así la división de células de rápido crecimiento y de los virus. 27/08/2008

41 separación de las cadenas.
ACRIDÍNA, ACTINOMICINA D Y ETIDIO Se intercalan entre las bases y dificultan la separación de las cadenas. BLEOMICINA, NEOCARZINOSTATINA Producen rotura de los enlaces entre los carbonos 3 y 4 de la ribosa. NETROPSINA Y DISTAMICINA A Se unen a zonas ricas en A-T. EJEMPLOS 27/08/2008

42 DESOXIADENOSINA  DIDANOSINA (ddI) + OH
NUCLEÓSIDOS ANÁLOGOS DESOXIADENOSINA  DIDANOSINA (ddI) + OH Se producen al modificar la porción de azúcar del nucleósido. TIMIDINA + N3  ZIDOVUDINA (AZT) AZIDO-3’-DESOXITIMIDINA (AZT)  VIH ARABINÓSIDO CITOSINA (ara C – Cytarabina)  QUIMIOTERAPIA ARABINÓSIDO ADENINA (ara A - Viradabina)  ANTIVIRAL EJEMPLOS 27/08/2008

43 INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN
2- Actúan sobre las enzimas de replicación (inhibidores específicos)  Forman complejos con el DNA impidiendo su desenrrollamiento y la separación de sus cadenas. 27/08/2008

44 EJEMPLOS AFIDICOLINA  DNA POLIMERASA NOVOBIOCINA Y
ACIDO NALIDÍXICO  DNA GIRASA AFIDICOLINA  DNA POLIMERASA EJEMPLOS 27/08/2008