LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO MYCOBATERIAS. (TBC).

Presentación del tema: "LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO MYCOBATERIAS. (TBC)."— Transcripción de la presentación:

1 LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO MYCOBATERIAS. (TBC)

2 MYCOBACTERIUM Son Gram positivos: Bacilos aerobios Inmóviles Acido alcohol resistente Restos y ligeramente curvos Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium africanum Mycobacterium bovis Son patógenos humanos, q componen el termino Mycobacterium tuberculosis

3 Clasificación de micobacterias patógenas para el ser humano. MicroorganismoPatogenicidadFrecuencia en Estados Unidos Complejo M.tuberculosis M. tuberculosisPatógeno estrictoFrecuente M. lepraePatógeno estrictoInfrecuente M. africanumPatógeno estrictoRara M. bovisPatógeno estrictoRara M. bovis (cepa BCG)Patógeno ocasionalRara Micobacterias no tuberculosas de crecimiento lento Complejo M. aviumGeneralmente patógenoFrecuente M. kansasiiGeneralmente patógenoFrecuente M. marinumGeneralmente patógenoInfrecuente M. simiaeGeneralmente patógenoInfrecuente M. szulgaiGeneralmente patógenoInfrecuente M. genavenseGeneralmente patógenoInfrecuente M. haemophilumGeneralmente patógenoInfrecuente M. malmoenseGeneralmente patógenoInfrecuente M. ulceransGeneralmente patógenoInfrecuente M. scrofulaceumPatógeno ocasionalInfrecuente M. xenopiPatógeno ocasionalInfrecuente Micobacterias no tuberculosas de crecimiento rápido M. abscessusPatógeno ocasionalInfrecuente M. chelonaePatógeno ocasionalInfrecuente M. fortuitumPatógeno ocasionalInfrecuente M. mucogenicumPatógeno ocasionalInfrecuente

4 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Bacilos aerobios Gram positivo débil Fuertemente acido-alcohol resistente Se transmite: Principalmente por vía respiratoria, al inhalar residuos secos en pequeñas gotitas infectadas Durante la infección primaria: Los bacilos inhalados viajan a los espacios alveolares, donde son ingeridos por los macrófagos, los siguientes días tras la infección se multiplican dentro de la célula Los macrófagos infectados emigran a los ganglios linfáticos regionales, linfa o torrente sanguíneo que regresa a los pulmones. Microscópicamente: Los tubérculos están formados por granulomas caseosos bien limitados, los organismos pueden ser vistos en cortes teñidos.

5 PRUEBA CUTÁNEA TEST CUTÁNEO O TEST DE MANTOUX La test cutánea es una reacción de hipersensibilidad a las proteínas del bacilo en las personas infectadas A las personas se les inyecta un derivado de proteico del bacilo (PPD), de 0,1 ml intracutanea La reacción se interpreta a las 48- 72 horas mediante el diámetro de induración en milímetros. Pacientes con VIH: una induración de 5mm o mayor se considera positivo. Paciente con factores de riesgo para tuberculosis: un resultado de 10mm o mayor es positivo En el resto de personas se considera positivo en una reacción de 15mm o mayor.

6 DIAGNOSTICO DE LABORATORIO Para el diagnostico de laboratorio se usan 2 métodos: BACILOSCOPIA (BK)CULTIVO Examen básico para el diagnostico y el control de la evolución del tratamiento de tuberculosis. Método bacteriológico mas sensible y especifico para la detección de M. tuberculosis y otras micobacterias. Aporta 20-25% mÁs casos a los diagnosticados por BK ¿QUE MUESTRAS SE PUEDEN USAR? En ambos casos podemos usar: MUESTRAS PULMONARES: Esputo MUESTRAS EXTRAPULMONARES: orina, liq. Pleural, liq. ascítico, heces, liq. sinovial, etc Se prefieren las muestras de esputo ya que facilita el aislamiento de las micobacterias, mientras que con las muestras extrapulmonares se necesita un numero mayor de muestras para cultivo y procesar grandes cAntidades de liquido o tejidos

7 Recolección de la muestra de esputo Una buena muestra proviene del árbol bronquial y se obtiene después de un esfuerzo de tos. Muestra suficiente: 5-10ml Hora de obtención: Cualquier hora del dia, pero se prefiere el primer esputo de la mañana y siempre antes del desayuno. Recomendación: Hacerse en un ambiente ventilado sin la presencia de otras personas. Envase Frasco de plástico estéril con tapa rosca

8 Recolección de la muestra 1. El envase debe ser de plástico y tapa rosca 2. Rotulación de la muestra de esputo 3. Enjuagarse la boca con agua, para eliminar residuos 4. Indicarle al paciente que la muestra de esputo debe provenir de la profundidad del pecho. 5. Ya obtenida la muestra, esta debe ser muco-purulento Respirar profundamente Retener el aire Lanzar violentamente el esputo al envase

9 FROTIS 1. Organización del área de Trabajo 2. Identificación de muestras y láminas 4. Fijación del extendido 3. Realización del extendido

10 BACILOSCOPIA (EXAMEN MICROSCOPICO) 1. COLORACION (TECNICA DE ZIEHL NEELSEN) 1. COLORACION DE BASILOS 2. DECOLORACION 3. COLORACION DE FONDO 1.Cubrir el colorante fucsina básica fenicada. 2.Calentar suavemente con el mechero de alcohol. 3.El tiempo de coloración 5 min. 4.Eliminar la fucsina con un suave chorro de agua. 5.Cubrir el extendido con la solución de alcohol ácido durante dos minutos, hasta obtener una coloración rosa pálido. 6. Una vez eliminado el alcohol ácido, lavar nuevamente la lámina con agua a baja presión. 7.Cubrir el extendido con el colorante azul de metileno, durante 30 segundos a un minuto. 8.Colocar las láminas coloreadas en orden numérico sobre el soporte de madera y dejar secar al medio ambiente.. Mycobacterium tuberculosis (coloración ZIEHL NEELSEN )

11 2. OBSERVACION Y LECTURA MICROSCOPICA DE LA MUESTRA COLOREADA Mycobacterium tuberculosis (coloración ZIEHL NEELSEN ) Se observa el preparado usando el objetivo 100x de inmersión. Los bacilos aparecerán como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, teñidos de rojo, aislados, en parejas o en grupos sobre un fondo azul claro. Es aconsejable seguir una pauta uniforme de observación y observar un mínimo de 100 campos útiles El objetivo de la observación y lectura es determinar la presencia o no de bacilos acido alcohol resistentes (BAAR); y establecer su número aproximado por campos observados.

12 3. INFORME DE RESULTADOS Mycobacterium tuberculosis (coloración ZIEHL NEELSEN ) Negativo (-): No se encuentra bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) en 100 campos microscópicos. Positivo (+): Menos de 1 BAAR promedio por campo en 100 campos observados Positivo (++): De 1 a 10 BAAR promedio por campo en 50 campos Observados. Positivo (+++): Más de 10 BAAR promedio por campo en 20 campos observados. Si se observa de 1 a 9 BAAR en 100 campos microscópicos, se adoptará la siguiente conducta:  Leer 100 campos microscópicos útiles más.  Si persiste el resultado se anotará el hallazgo en el registro y la muestra se enviará para cultivo.

13 CULTIVO MEDIOS DE CULTIVO SOLIDOS MEDIOS DE CULTIVO BACTEC-460 SEPTI.CHECK AFB Tubos indicadores del crecimiento de micobacterias. BBL Sistema de cultivo ESP II BacT/AlertMB MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS Son mas sensibles que los solidos. Aportan una detccion mas rápida del crecimiento micobacteriano. Lówenstein-Jensen Middlebrook 7H10 y 7H11. OGAWA Son los habitualmente usados. Ventaja: permiten la visualización de la morfología y la pigmentación de las colonias. Desventajas: Tiempo prolongado de crecimiento. Baja sensibilidad: Tenemos 2 tipos de muestras para la realización de un cultivo:  Muestras asépticamente recolectadas: Obtenidas por punción (LCR, liq. Pleural, liq peritoneal y liq. sinovial) y las muestras obtenidas por biopsia (tej. Pulmonar, hígado y ganglio).  Muestras tomadas de sitios contaminados: el esputo, otras secreciones respiratorias, secreciones gástricas, orina, heces, etc. Las muestras deben ser descontaminadas antes de su inoculación al medio de cultivo para evitar el sobrecrecomiento de otros microorganismos. Para la desontaminacion se usa se usa N-acetil-L-cisteína al 2% e Hidroxido sódico.

14 CULTIVO Se utiliza para: Paciente sintomático respiratorio con BK (-) y radiografía de pulmones con sospecha de TB (Rx anormal). Paciente paucibacilar Muestras extrapulmonares de casos con sospecha de tuberculosis extrapulmonar. MEDIOS DE CULTIVO: Lówenstein-Jensen Middlebrook OGAWA El desarrollo de M. tuberculosis aparece entre 2-3 semanas Las colonias típicas son color crema rugosas con aspecto de coliflor u de bordes irregulares. Desarrollo de colonias antes de 48h, indica contaminación. Despues de 48h se debe descartar contaminación: alcalinizada (color blanco amarillento) o acidificado (color azul oscuro por mala descontaminación de la muestra). Si no se observan colonias a las 2-3 semanas, se deja el cultiva hasta 8 semanas antes de informarlo como negativo.

15 Lectura semicuantitativa de los cultivos

16 Es un problema critico, creciente en nuestro país, se busca d(x) mas rápidos de los patrones de resistencia para su inmediato inicio de tratamiento. Estos métodos d(x) son : PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTITUBERCULOSAS Muchos microorganismos son resistentes a ciertos antibióticos. Las pruebas de sensibilidad importantes para ayudar a encontrar el antibiótico apropiado para usted muestra de esputo direct. prueba necesita de una cepa previa (realizando un cultivo de la muestra de esputo, de donde se sacará la respectiva cepa en la que se realizará la prueba de sensibilidad). DIRECTOS INDIRECTOS

17 Es una prueba no comercial que se basa en la capacidad del complejo M. tuberculosis para reducir los nitratos a nitritos., y que está contemplada por la OMS para el cribado de la sensibilidad a la isoniacida y a la rifampicina en países de bajos recursos económicos. Sencilla, económica Es una técnica con buena sensibilidad (95- 98%) y especificidad (99-100%) METODO GRIES VENTAJAS ¿Cómo SE HACE ? RESULTADOS INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS tubos de Löwenstein-Jensen (L-J) que incorporan KNO3 Trabaja con dos tamaños inoculo 1ERO para los tubos de L-J que contienen los fármacos 2DO está diluido al 1:10 para los tubos de control (sin fármaco). incubación de 7-14 días a 37ºC, se estudia posible reducción Resultado negativo no hay cambio de color interpreta como sensible Resultado positivo se obs. Cambio de color de rojo o violeta intenso se interpreta como resistente

18 cultivo direct. de muestras de esputo en med. líq., detecta Mycobacterium tuberculosis y evalúa la susceptibilidad frente a isoniacida y rifampicina. Se basa en que el crec. bacteriano en forma de cordones que se visualiza través de un microscopio de luz invertida VENTAJAS ¿COMO SE HACE ? RESULTADOS INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Bajo costo Rapidez para detectar micobacterias multirresistentes sensibilidad (95-98%), especificidad (96- 100%), DESVENTAJAS Tener microscopio invertido Entrenamiento reconoc. Formac. de cordones METODO MODS medio líquido (suplementado) en placas de microdilución. Unos pocillos tendrán los fármacos en concent. críticas y otros de control sin fármacos. Tras la inoculación, la placa se tapa se incuba con CO2 a 37ºC. Obs. microscopio invertido a 40x, se examinará a las 48 h posib. Contaminaciones) partir del 5º día, en busca de cuerdas (micobacterias viables). Una cepa se considerará resistente a los fármacos cuando desarrollan cuerdas en los pocillos. Los resultados suelen estar disponibles entre 7 y 14 días

19 Calcular la proporción de bacilos resistentes que están presentes en un cultivo. Utilizando dos diluciones de bacilos, una más alta y otra más baja, se inoculan en medios de cultivo con y sin antibiótico, con el fin de obtener colonias cuantificables METODO DE PROPORCIONES MULTIPLES VENTAJAS ¿COMO SE HACE ? RESULTADOS INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Alta reproductibilidad Elevada correlacion clínica Bajo costo Estandar de oro se utiliza el medio sólido de Lowenstein Jensen adicionaron los medicamentos a probar a una concentración crítica por mililitro antes de ser coagulados a 80ºC. Se recomienda analizar las siguientes concentraciones críticas: isoniacida 0,2 mg/L; rifampicina 1 mg/L; estreptomicina 2 mg/L; etambutol 5 mg/L (en medio 7H10 de Middlebrook) o 7,5 mg/L (en medio 7H11 de Middlebrook) Los resultados se interpretan a los 21 días de incubación a 37ºC Por debajo del 1%, la cepa se clasifica como sensible y por encima, como resistente DESVENTAJAS Demora obtención de resultados

20 Caso clínico: Se presenta el caso de una chica joven de 33 años de edad, sin antecedentes médicos de interés, no fumadora y que trabaja como administrativa en un consultorio médico, donde la población inmigrante constituye un alto porcentaje de la población, y tratándose de una zona de transformación social, atendiendo a población en riesgo de exclusión social. Inicialmente presentó Febrícula mal estar general tos escasa y mialgias tratándose como un cuadro pseudogripal con antitérmicos y reposo en domicilio hasta mejoría. Una semana después y ya incorporada al trabajo presenta un esputo hemoptoico por lo que se inicia el estudio con analítica, radiografía de tórax y Mantoux.

21 Exploración: Buen estado general. No impresiona de enfermedad. Talla: 1.67; Peso: 62kg; IMC: 22,23. Buena coloración de piel y mucosas. S02:97-98%.FC:84lpm. No focalidad neurológica. No adenopatías cervicales. No se palpa bocio ACR: Tonos rítmicos, no soplos. Hipoventilación en base pulmonar derecha y crepitantes finos. Resto de la exploración por órganos y aparatos sin datos de interés.

22 Pruebas Complementarias: Analítica: Leucocitos: 5110, Neutrófilos 40%, Linfocitos 30%. Hematíes: 4.750.000; Hemoglobina: 14,3; Hematocrito: 41,8; VCM: 8. VSG: 19 y PCR: 2(0.01-0.50). Lectura del Mantoux: 18mm a las 72 horas. Radiografía de Tórax: Nódulo en LSD (imagen 1 e imagen 2) y un agrupamiento broncovascular paracardiaco derecho.

23 Figura 1Figura 2

24 Ante la clínica que presenta la paciente, el resultado del Mantoux positivo y una radiografía de tórax sugerente de tuberculosis se deriva al hospital para continuar el estudio de sospecha de tuberculosis pulmonar. Estando ingresada se completa el estudio con TAC torácico y baciloscopias. Informe del TAC: En el lóbulo superior derecho se observan múltiples opacidades nodulares centrolobulillares. Engrosamiento intersticial intralobulillar e imágenes de “árbol en brote” (bronquiolos terminales ocupados por moco, pus o sangre). Pequeña área atelectásica de morfología triangular en segmento medial del lóbulo medio sin evidenciarse causa obstructiva. Baciloscopia positiva :1-9 BAAR+/10 campos.

25 Diagnóstico: El principal diagnóstico en este caso sería el de TUBERCULOSIS PULMONAR, el estar en contacto con población inmigrante, los datos clínicos junto a las pruebas de imagen y Mantoux orientan al diagnóstico.