LOS METODOS DE DIAGNOSTICO PARA LA DETECCION DE PATOGENOS FUNGICOS EN SEMILLAS DE HORTALIZAS CATEDRA:PRODUCCIÓN Y MANEJO DE SEMILLAS CATEDRATICO : EMERSON.

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1 LOS METODOS DE DIAGNOSTICO PARA LA DETECCION DE PATOGENOS FUNGICOS EN SEMILLAS DE HORTALIZAS CATEDRA:PRODUCCIÓN Y MANEJO DE SEMILLAS CATEDRATICO : EMERSON CARRASCO LOZANO PRESENTADO POR: CARDENAS PALACIOS LUIS LEON VILA JORDY LUIS GUTIERREZ ROJAS JAVIER MANTARO - 2018

2 LOS METODOS DE DIAGNOSTICO PARA LA DETECCION DE PATOGENOS FUNGICOS EN SEMILLAS DE HORTALIZAS

3 El diagnóstico precoz de hongos patógenos transmitidos por semilla es importante, ya que, las semillas infectadas aparecen sin síntomas; el diagnóstico semilla puede evitar la propagación incontrolada de los patógenos a través del intercambio de larga distancia de dicho material. Esto evitará las pérdidas económicas y el uso innecesario de fungicidas, por lo tanto la reducción de costos y la introducción de productos tóxicos al medio ambiente. Las técnicas tradicionales para la detección de hongos transmitidos por semilla se basan en la incubación y métodos de crecimiento. Recientemente, nuevas técnicas de identificación, basadas en análisis de ADN, se han aplicado y son muy eficientes debido a la alta sensibilidad y especificidad. La técnica más común es la PCR convencional, mientras que otras técnicas recientes incluyen: PCR anidada, obviar niveles bajos de patógenos objetivo, PCR multiplex, para detectar varios patógenos simultáneamente, PCR en tiempo real, para cuantificar hongos en semillas, PCR de hibridación por captura magnética Los principales inconvenientes de los métodos moleculares son la incapacidad para distinguir entre inóculos vitales y no vitales, y la dificultad de obtener una plantilla de ADN de calidad, debido a a los inhibidores de la PCR en las semillas.Para reducir los efectos inhibitorios, varios protocolos de PCR modificado, tales como mediada por bucle isotérmica amplifi cación, y métodos de ensayo no destructivos se han desarrollado.

4 INTRODUCCION El movimiento de germoplasma vegetal y cualquier otro crudo material vegetal puede plantear grandes riesgos para la propagación de enfermedades y plagas (Gergerich et al., 2015). En particular, las semillas representan un vehículo particularmente eficiente para dispersar patógenos transmitidos por la semilla. A diferencia de las plantas vegetativas infectadas, las semillas infectadas son, en la mayoría de los casos, asintomáticas; además los bajos porcentajes de infección de semilla pueden resultar en pérdidas severas de cultivos (Pellegrino et al., 2010), particularmente si los patógenos son microorganismos de cuarentena. La estrecha asociación de hongos con semillas facilita la supervivencia a largo plazo y amplia difusión de patógenos. Muchos países han formulado una legislación que ayuda a limitar o impedir la introducción de patógenos exóticos en nuevas áreas, y estos son por lo general con el apoyo de técnicas de detección. Sin embargo, los niveles de inóculo bajos y la distribución a menudo no uniforme en los lotes de semillas hacen la prueba de semillas para los patógenos una tarea dificultosa. Durante las últimas décadas, la llegada de las herramientas serológicas y moleculares ha promovido esfuerzos para establecer ensayos con tecnología especifica y aspectos técnicos ( especificidad, sensibilidad, robustez) y las demandas económicas (por ejemplo, corto tiempo de diagnóstico) OBJETIVO La presente revisión describe y analiza críticamente el técnicas de diagnóstico tradicionales e innovadoras que se han aplicado a patógenos fúngicos transmitidos por la semilla.

5 ENSAYOS CONVENCIONALES DE DETECCION DE HONGOS EXAMINACION VISUAL Algunos hongos patógenos pueden causar síntomas de semillas que son visibles, o al menos bajo aumento (Chen et al., 2007). A veces los síntomas pueden ser atribuidos a ciertas especies de hongos, tales como decoloración, arrugamiento y grietas en las semillas de soya que son típicos de Phomopsis spp. y Cercospora kikuchii (Murakishi, 2002; Li, 2011), y las motas presentes en semillas de maní que son causadas por parasiticum Cylindrocladium (Randall-Schadel et al., 2001). El examen de semillas bajo un microscopio estereoscópico permite la detección de la presencia de estructuras reproductivas de hongos, tales como la corteza de oosporas de Peronospora manshurica en semillas de soya (Agarwal et al., 2006), el acérvulos y microsclerotia de Colletotrichum dematium en semillas de chile (Kumar et al., 2004), y los picnidios de Septoria apii incrustado en la testa de las semillas de apio (Horst, 2008). Sin embargo, cuando las semillas que están infectadas por hongos no muestran síntomas macroscópicos, ningún tipo de inspección visual tiene una base racional como un ensayo de detección (Walcott, 2003). Las técnicas de lavado de semillas se pueden usar en combinación con el examen visual y son útiles para las pruebas de hongos patógenos de superficie o cuando los hongos transmitidos por la semilla están presentes como esporas microscópicas en la superficie de la semilla (Agarwal et al., 2006). Estas tecnologías permiten la eliminación de esporas, elementos de hifas o otras estructuras fúngicas de las semillas por lavado y agitándolos en agua destilada (Reeves, 1998).

6 BIO PCR Consiste en una etapa de incubación pre-ensayo para aumentar la biomasa del patógeno fúngico sobre las semillas que es seguido por la extracción de ADN y de cationes amplificador por PCR. inicialmente esta técnica se aplica principalmente para bacterias Fito patógenos, ya que son fácil y rápidamente cultivaron durante 2 - 3 días en un medio de crecimiento también ha demostrado ser eficaz para los hongos.

7 BIO-PCR tiene varias ventajas sobre PCR tradicional: aumento de la sensibilidad, la eliminación de inhibidores de la PCR y la detección de solamente las células viables, evitando así falsos positivos debido a la detección de ADN a partir de células muertas. Los aspectos negativos de BIOPCR son que es más caro que el PCR convencional,especialmente si se utilizan medios selectivos por lo general requiere 5 a 7días para el crecimiento de hongos lo que significativamente aumenta el tiempo necesario para la finalización de los ensayos

8 PCR ANIDADA Otra forma de obviar los bajos niveles de hongo objetivo en semillas es el uso de PCR anidada este procedimiento se puede mejorar la sensibilidad y especificidad del ensayo, permitiendo así la detección de un ADN diana en varias veces los niveles más bajos que para la PCR convencional. Este ensayo molecular es más mano de obra, más costosas, y más propenso a la contaminación que PCR convencional.

9 MAGNETISMO DE CAPTURA DE HIBRIDACION DE LA PCR Magnética-captura por hibridación (MCH) -PCR combina la extracción de ADN inicial con un paso de purificación que incluye la hibridación con una sonda de ADN monocatenario en perlas magnéticas, con la posterior PCR amplificación de la región de ADN relevante. Esta tecnología puede capturar específica de ADN diana c, facilitando así la detección de secuencias de ADN c especifico por PCR. MCH-PCR se ha utilizado con éxito para detectar microorganismos patógenos en los materiales que contienen compuestos inhibidores de la PCR,por ejemplo aclada Botrytis en semilla de cebolla.

10 MEDIANA LOOP ISOTERMICA AMPLIFICACION Loop mediada isotérmica amplificación (LAMP) de ADN es una tecnología reciente que fue desarrollado por Notomi et al. ( 2000) como un simple, rentable y método rápido para la detección específico de ADN genómico. Esta tecnología tiene varias características positivas: todas las reacciones se pueden llevar a cabo en condiciones isotérmicas que no requiere equipo costoso y hay menos etapas de preparación en comparación con la PCR convencional y los ensayos de PCR en tiempo real.

11 OTRAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO RECIÉN DESARROLLADOS Una herramienta aplicado recientemente que pueden revelar la presencia de hongos patógenos en las semillas se conoce como la técnica de láser 'biospeckle'. Esta técnica se basa en el fenómeno óptico de la interferencia que se genera por una luz láser que interacciona con la cubierta de la semilla el examen de semillas bajo luz láser permite la identificación de áreas con diferentes actividades Como los hongos presentes en las semillas tienen actividad biológica, este método detecta su presencia en la semilla.

12 Diagnóstico de Patógenos Importantes Transmitidos por semillas de cultivos de hortalizas

13 Zanahoria Daucus carota Alternaria dauci (tizon foliar), Alternaria radicina (pudricion negra) y Alternaria carotiincultae Estas enfermedades se han extendido a todas las áreas de producción de zanahoria en el mundo, se da zanahorias son cultivado en condiciones de temperaturas moderadas, donde las hojas están expuestas a períodos prolongados de humedad debido a la lluvia, el rocío o el riego por aspersión (Pryor, 2002; Rogers y Stevenson, 2010). Alternaria carotiincultae es otra especie que se identificó más recientemente en zanahoria silvestre; es similar en muchos aspectos a A. radicina, que causa síntomas similares de la enfermedad (Simmons, 1995).

14 La eficiencia de los métodos para la detección de Alternaria spp. en las semillas de zanahoria está influenciada por la ubicación de los patógenos en la semilla, y por la presencia de microorganismos saprófitos. Para eliminar microorganismos no deseados, la esterilización superficial permite una evaluación más precisa de la incidencia de estos patógenos. Enjuague de semillas de zanahoria en 0.1% de hipoclorito de sodio se ha informado que aumenta la recuperación de A. dauci en un ensayo de blotter 2,4-D, y para reducir las semillas saprófitos (Strandberg, 2002). Para superar estos inconvenientes, la aplicación de métodos de tratamiento térmico en 100 ° C por 1 h permite la detección de altos niveles de semilla infección sin comprometer la presencia de patógenos, mientras que al mismo tiempo reduce los efectos de enmascaramiento de la microflora de semillas (Soteros, 1979). Para permitir la esporulación fúngica, y en consecuencia la identificación de algunas especies, la congelación estándar método de blotter es eficente para Alternaria spp. (Konstantinova et al., 2002; Bulajic et al., 2009). La identificación se basa en diferentes características morfológicas y estructuras de estas especies: A. radicina se forma no catenulada, conidios multicelulares, sin pico, mientras que formas de A. dauci conidios multicelulares solitarios con picos largos. El conidial las dimensiones de A. radicina son menores que las de A. dauci (Konstantinova et al., 2002; Pryor & Gilbertson, 2002; Farrar et al., 2004). Las características morfológicas de A. carotiincultae difiere de los de A. radicina: mayor longitud media del conidio, menos obovoide y subesférico mayor frecuencia de conidios que se producen en cadenas de dos, o menos comúnmente, tres (Pryor Y Gilbertson, 2002).

15 La producción de conidios por parte de muchas Alternaria spp. Es sujeto a la influencia de una serie de condiciones ambientales condiciones, como temperatura y cantidad y calidad de luz. Para la detección de A. dauci en semillas de zanahoria infestadas, un agar modificado permite obtener altos niveles de infección de semilla, por lo tanto proporcionando un ensayo más sensible que el método del blotter. Alternaria radicina se puede identificar mediante el uso de medios selectivos creados específicamente para esta especie (Pryoret al., 1994) Alternaria dauci las colonias son de color marrón o marrón oscuro con micelio de color verde oliva. Los aislados de Alternaria radicina crecen lentamente con márgenes de colonias irregulares y producir dendríticas cristales y un pigmento amarillo difusible (Pryor & Gilbertson,2002). A. carotiincultae crece más rápido y no produce cristales o pigmento. En BIO-PCR, luego de incubación de las semillas puede aumentar la biomasa de hongos. Luego, el uso de primers específicos para A. dauci y A. radicina durante los ensayos de PCR es altamente sensible, con detección incluso de baja infección niveles y diferenciación entre estos Alternaria spp. (Konstantinova et al., 2002). Datos obtenidos usando el método del blotter y las incubaciones en medios selectivos son similares a las obtenido después de la aplicación de métodos moleculares, aunque los métodos moleculares consumen menos tiempo

16 Brassica spp. Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans y Plasmodiophora brassicae Alternaria brassicae y L. maculans son los agentes causales de la enfermedad de la mancha negra y la enfermedad de pie negro, respectivamente. Estos son importantes patógenos transmitidos por semillas que afectan a Brassica spp., y puede causar serias reducciones en los rendimientos de los cultivos (Howlett et al., 2001; Lancaster, 2006). Otra enfermedad económicamente importante de la familia Brassicaceae es clubroot, que es causado por el parásito obligado P. brassicae, un patógeno transmitido por el suelo, y también por semilla, (Dixon, 2009; Hwang et al., 2012). Para la identificación de A. brassicae, se uso pcr en tiempo real, estos se aplicaron utilizando dos pares de cebadores que fueron diseñados sobre la base de la secuencias de dos genes agrupados que son potencialmente involucrado en la patogenicidad. Antes de la extracción de ADN de las semillas, es aconsejable un paso de incubación de unos pocos días para aumentar la biomasa fúngica, utilizando un 2% de extracto de malta, 2% dextrosa y 0,1% de peptona en medio de cultivo líquido.. Para detectar L. maculans en muestras de semillas, puede usarse el método filtro de papel / congelación, aunque PCR con un par de cebadores específicos de especie es igualmente efectivo y consume menos tiempo (Mahuku et al., 1996; Chen et al., 2010). BIO-PCR con un medio específico para L. maculans puede ayudar a aumentar la biomasa de este hongo en Brassicaceae semillas (Taylor, 1993). Un protocolo basado en PCR en tiempo real que usa cebadores específicos ha sido desarrollado para la cuantificación de esporas de P. brassicae en descanso, que son contaminantes externos en semillas de canola.

17 Cucurbitáceas Didymella bryoniae, Verticillium dahliae y Fusarium spp. El tizón del tallo gomoso (podredumbre negra) es una enfermedad foliar grave que afecta los cultivos de Cucurbitáceas. La enfermedad es causada por el hongo D. bryoniae, que produce lesiones en los tallos y las hojas. Didymella bryoniae también puede ser propagación por semillas, ya que se encuentra tanto externamente en e internamente en las semillas (Sudisha et al., 2006). Verticillium dahliae y Fusarium spp. son destructivos en el suelo y patógenos transmitidos por las semillas que pueden infectar a muchos cultivos agrícolas de importancia económica en todo el mundo, incluyendo Cucurbitaceae (Trionfetti Nisini et al., 2002; Rampersad, 2008). PCR-ELISA se ha utilizado con éxito para detectar D. bryoniae en extractos crudos de muestras de hongos aisladas de plantas de cucurbitáceas infectadas. Aunque es menos sensible que el gel electroforesis, PCR-ELISA es altamente específico, ensayo simple y rápido(Somai et al., 2002).

18 Allium cepa Botrytis spp. Siete Botrytis spp. han sido asociados con enfermedades de Cultivos de Allium: B. aclada, B. allii, B. byssoidea, B. cinerea, B. porri, B. squamosal y B. tulipae (Mohan y Schwartz, 2005). Botrytis aclada, B. allii, B. byssoidea y B. porri se consideran los principales agentes causales de putrefacción del cuello de la cebolla, una enfermedad que puede desarrollarse durante el almacenamiento y eso puede causar una pérdida severa de bulbos de cebolla. Aunque B. squamosa y B. tulipae también han sido asociados con la putrefacción del cuello, estas especies no son típicamente las causas principales (Chilvers et al., 2004; Chilvers & Du Toit, 2006). Para la determinación de la salud de las semillas de cebolla, varios procedimientos pueden ser utilizados para aislar Botrytis spp. Las semillas pueden incubarse en medio de agar y, para evitar la aparición de hongos de crecimiento rápido. Para Botrytis spp, se pueden platear en una medio selectivo como el agar de Kritzman. Esto proporciona varias ventajas sobre otros medios, esta llibre de contaminantes secundarios y facilidad de identificación de Botrytis spp. (Kritzman y Netzer, 1978).

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20 Conclusión La presente revisión ha cubierto los métodos de diagnóstico que puede usarse para detectar e identificar patógenos fúngicos llevado por semillas de cultivos de hortalizas. Además de reducir la cantidad y calidad de la semilla cosechada, los patógenos se pueden preservar en lotes de semillas, que pueden proporcionar un impulso masivo a la propagación de patógenos de plantas (Mancini y Romanazzi, 2014). Las semillas son altamente vulnerables a infección y / o contaminación, y diagnóstico de semillas puede ser particularmente difícil, porque en la mayoría de los casos, las semillas no muestra síntomas visibles, a diferencia de otros tejidos vegetales (Schaad et al., 2003). La aplicación de métodos de detección basados ​​ en ácidos nucleicos permite estos deficiencias que deben superarse, ya que estos son más específicos y sensible, y proporcionan datos que son fáciles de interpretar en un corto tiempo. Sin embargo, los inhibidores de PCR pueden limitar la aplicabilidad de estas tecnologías moleculares, aunque la integración de convencional o en tiempo real La PCR con BIO-PCR y MCH-PCR permite evitar este problema, y mejora la detección de patógenos en semilla.